Zpracování dat pomocí softwaru Thermo Freestyle s vyhledáváním NIST MSMS pro identifikaci sloučenin (nastavení vyhledávání NIST a parametrů Freestyle)

Tato série webinářů ukazuje použití softwaru Thermo Freestyle 1.8 SP2 QF1 pro zpracování LCMS hmotnostních spekter produktových s iontů pomocí programu NIST 23 Mass Spectral Search Program (v.3.0). Spektra se snadno exportují ze softwaru Freestyle do programu NIST Search pro identifikaci jednotlivých složek s využitím knihoven NIST MSMS a všech dalších dostupných uživatelských, veřejných a komerčních MSMS knihoven. Freestyle je velmi pohodlný softwarový balík pro zpracování dat získaných pomocí přístrojů LCMS Orbitrap. V jedné analýze lze získat spektra MS1 i MS2 v režimu pozitivních i negativních iontů. Lze také snadno zobrazit PAD a UV-VIS data pro zaměření požadovaných látek z LC analýz.

Materiály ke stáhnutí pro celou sérii

• Část 1: Můj oblíbený režim zpracování ve Freestyle
• Část 1A: Používání vylepšeného režimu zpracování „Nearby Precursor“ v aplikaci FreeStyle
• Část 2: Alternativní režimy zpracování ve Freestyle
• Část 3: Nastavení základních nastavení ve Freestylu a vyhledávání NIST
• Část 4: Demonstrace různých vyhledávání NIST MSMS
• Část 5: Zpracování prvků v Thermo Freestyle

Část 3: Zpracování dat pomocí softwaru Thermo Freestyle s vyhledáváním NIST MSMS pro identifikaci sloučenin (nastavení vyhledávání NIST a parametrů Freestyle)

Vybavení a software

• Thermo Orbitrap MSMS
• Software Thermo Freestyle
• Vyhledávání NIST MSMS

Tato příručka popisuje, jak zpracovávat data MS/MS pomocí softwaru Thermo Freestyle a nástroje NIST MSMS Search pro přesnou identifikaci sloučenin. Obsahuje pokyny pro nastavení krok za krokem, tipy pro konfiguraci parametrů vyhledávání a strategie pro zlepšení přesnosti hmotnosti a výsledků interpretace.

Začínáme s Freestyle a NIST

1. Počáteční nastavení

• Otevřete datový soubor v aplikaci Freestyle.
• Zobrazte spektrum MS2 (pozitivní nebo negativní mód).
• Aktivujte okno MS2 kliknutím na jeho záhlaví.
• Kliknutím na ikonu Library Search (Vyhledávání v knihovně) spusťte interní vyhledávání NIST.

2. Klíčová nastavení ve Freestyle

• Pod ikonou Library Search (Vyhledávání v knihovně) vyberte možnost NIST Search (Vyhledávání NIST).
• Změňte režim na MS/MS, klikněte na Make Default a poté na Apply
• Tím zajistíte export hodnot m/z se čtyřmi desetinnými místy.

James Little: Část 3 - Klíčová nastavení v Thermo Freestyle

Export do NIST MSMS Search

1. Klikněte na tlačítko Export to NIST s aktivním spektrem MS2.
2. V externím okně NIST MSMS Search nakonfigurujte možnosti importu:
   • Ujistěte se, že je vybrána možnost Accurate m/z.
   • Potvrďte 4 desetinná místa pro prekurzorové a produktové ionty
3. Pomocí ikony Switch to Caller se vraťte do Freestyle

James Little: Část 3 - Funkce Switch to Caller

Použití NIST MSMS Search 3.0 (tandemový mód)

Rychlé nastavení

• Použijte přiloženou příručku pro rychlé spuštění pro NIST 2023.
• Upravte nabídky v závislosti na svých datech a cílech vyhledávání.

Možnosti importu spektra

• Odfiltrujte ionty s nízkou intenzitou a elektronický šum.
• Nastavte možnosti v části Možnosti vyhledávání v knihovně > karta MS/MS.

James Little: Část 3 - Typická nastavení pro NIST MS Search 3.0 (tandemový mód)

Režimy vyhledávání

• Identita MS/MS: Omezuje vyhledávání podle m/z prekurzoru.
• Identita/Vysoké rozlišení: Ignoruje m/z prekurzoru pro širší porovnání.
• Similarity/Hybrid MS/MS: Vyhledá podobná spektra, i když v knihovně není přesná shoda.

Poznámka: Vyhledávání hybridních záporně nabitých iontů může vykazovat posunuté hodnoty hmotností v důsledku nesprávného nastavení mezi M+H a M-H.

Filtrování a zjednodušování výsledků

• Použijte možnost Povolit filtrování (pouze tandemový mód).
• Zrušte výběr možnosti Include MS3+ Spectra (Zahrnout MS3+ spektra), abyste se vyhnuli komplexním MS3+ datům v seznamech shod.
• Použijte možnost Best Matching Only (Pouze nejlepší shoda) pro zjednodušení odstraněním duplicit se stejným číslem CAS.

James Little: Část 3 - Další nastavení pro NIST MS Search 3.0 (tandemový mód)

Uložit nastavení

Jakmile budete s konfigurací spokojeni:

• Uložte nastavení pomocí Save Configuration.
• Pro jejich opětovné načtení v budoucích relacích použijte Restore Configuration (Obnovit konfiguraci).

James Little: Část 3 - Uložte si nastavení pro budoucí relace

Zvláštní poznámky z uživatelské příručky knihovny NIST 20 Tandem

• NIST nabízí více knihoven (HR, LR, APCI, zaměřené na peptidy).
• Tolerance fragmentových iontů pro spektra s nízkým rozlišením je stanovena na ±0,5 m/z.
• Doporučuje se:
  • Toleranci produktových iontů nastavte na 0,01 m/z.
  • Ignorujte píky kolem prekurzoru (20 ppm).
  • Vyhněte se "scoringu" peptidů, pokud nepoužíváte peptidové knihovny.
• Ke zpřesnění vyhledávání použijte filtry Constraints, Limits a Hit List.

Tipy pro zobrazení

Přizpůsobte si zobrazení seznamu hitů:

• Přidejte sloupce: Prec. Type, Instr. Type, Energy a DeltaMass.
• Přístup k možnostem zobrazení přes kliknutí pravým tlačítkem myši na seznam hitů → Vlastnosti.