Průvodce řešením problémů v HPLC - chromatografické píky

V prvním díle seriálu o řešení problémů v HPLC jsme se podívali na základní tipy jak Váš HPLC systém provozovat a také osvědčené postupy pro odstraňování problémů, pokud se nakonec vyskytnou. Druhý díl série přináší detailnější pohled na problematiku chromatografických píků

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC

Kompletní příručka dostupná ke stažení v knihovně!

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Žádné píky

Žádné píky

Problémy s nastavením detektoru

• Zkontrolujte, zda je zapnutá lampa detektoru
• Zkontrolujte, zda jsou připojeny elektrické kabely
• kontrolujte životnost lampy a v případě překročení ji vyměňte
• Zajistěte, aby byl dle fyzikálně chemických vlastností analytu použit vhodný detektor
• Zkontrolujte, zda metoda používá vhodné nastavení detektoru odpovídající hledaným látkám

Eluční čas analytů delší než doba analýzy

• Zkontrolujte složení mobilní fáze
• Zkontrolujte, zda se používá správná kolona
• Prodlužte čas analýzy
• Zvyšte eluční schopnost mobilní fáze

Problémy se vzorkem

• Zajistěte, aby se vzorek nezměnil. Připravte čerstvé vzorky
• Ujistěte se, že je vzorek v autosampleru je ve správné poloze
• Problém s adsorpcí vzorku

Ucpaná jehla

• Pokuste se odstranit ucpání nebo vyměnit jehlu
• Zjistěte, proč je jehla ucpána (např. septem nebo špatnou přípravou vzorku)

Přístroj

• Žádný průtok mobilní fáze, případně proplachovací ventil ponechán otevřený
• Odvzdušněte systém, abyste odstranili možné vzduchové bubliny v čerpadle
• Propláchněte injektor, abyste odstranili vzduchové bubliny v dávkovacím čerpadle

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Dvojité píky

Zdvojené píky

Znečištěný vstup kolony nebo předkolony

• Vyměňte předkolonu nebo předfiltr nebo vloženou filtrační fritu
• Propláchněte předkolonu nebo vlastní kolonu zpětným tokem (pokud lze)

Rozpouštědlo vzorku je nekompatibilní s mobilní fází

• Vyměňte rozpouštědlo vzorku
• Použijte počáteční složení mobilní fáze (pokud ze)
• Použijte funkci vstřikování Co-Solvent nebo POISe

Vlastnosti analytu

• Možnost změny izomeru nebo analytu - změňte podmínky

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Chvostující píky

Chvostující píky

Sekundární interakce

• U zásad zvyšte pH (jak lze); u kyselin snižte pH
• Zvyšte iontovou sílu pufru (jak lze)
• Změňte kolonu

Mrtvý objem

• Znovu připojte kolonu s fitinky pro redukci mrtvého objemu.

Degradace kolony

• Vyměňte kolonu

Trhliny v koloně

• Vyplňte trhlinu (pravděpodobně ale vlastnosti kolony už nebudou dobré).

Interferující pík

• Použijte delší kolonu; další vývoj metody

Nevhodné pH mobilní fáze

• Upravte pH (doporučují se 2 jednotky pH od pKa).

Chelatace vzorku na aktivních místech

• Omezte interakci pomocí ion párového činidla, modifikátoru nebo sekvestračního činidla
• Změňte kolonu nebo průtokovou cestu za a injektorem

Nedostatečná pufrace

• Použijte koncentraci pufru 50-100 mM (UV metody)

Nástřik vzorku

• Snižte koncentraci vzorku

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Čelní chvostování

Čelní chvostování

Degradace kolony

• Vyměňte kolonu

Mobilní fáze/rozpouštědlo vzorku nejsou kompatibilní

• Upravte složení mobilní fáze.
• Použijte počáteční složení mobilní fáze (pokud lze)

Přetížení vzorkem

• Snižte koncentraci vzorku

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Široké píky

Široké píky

Nástřik vzorku

• Snižte koncentraci vzorku nebo nástřik

Problém s kolonou

• Degradace kolony, kolona by měla být vyměněna

Problém s nastavením termostatu kolony

• Zkontrolujte správnou teplotu termostatu. Vyšší teplota kolony obvykle vede k rychlejší eluci látek (pozor na teplotní limit kolony doporučený výrobcem)

Mobilní fáze

• Ověřte, že používáte správnou mobilní fázi

Nastavení přístroje

• Zvyšte vzorkovací frekvenci detektoru pro zjištění, zda se zlepší tvar píků
• Dlouhé kapiláry a další faktory zvyšující vnitřní objem systému rozmývají píky, zkontrolujte možnosti omezení
• Zkontrolujte, zda je nastaven správný průtok MF (mobilní fáze) a je dodržován

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Píky navíc

Píky navíc

Další látky ve vzorku

• Pokud jsou ve vzorku další látky, není to chyba

Píky s dlouhým RT z předchozí analýzy

• Prodlužte RT (retenční čas), nebo zvyšte eluční sílu MF
• zvyšte průtok MF

Ghost píky

• Zkontrolujte čistotu MF
• Použijte trap ghost píků (je-li možno)