Jak správně přistoupit ke scale-upu analytické metody při jejím přenosu do preparativní chromatografie? Část první

V preparativní chromatografii sledujeme tři hlavní cíle. To, jak je mezi sebou vyvážíte, určuje, jakým způsobem budete přistupovat ke scale-upu z analytického měřítka na preparativní, tedy k velkoobjemovým HPLC purifikacím.

Část 1: Optimalizace separace

V preparativní HPLC je nutné vždy nalézt rovnováhu mezi čistotou, výtažností a průchodností (throughput). Velmi často je nutné jednu z těchto hodnot obětovat, aby mohly být dosaženy zbývající dvě. Tři níže uvedené modelové situace ukazují různé výsledky podle toho, které parametry jsou prioritou:

• Vlevo: lze dosáhnout rovnoměrného kompromisu, kdy jsou splněny všechny tři požadavky, i když žádný z nich nedosahuje maxima.
• Uprostřed: můžete upřednostnit čistotu a výtěžnost, avšak za cenu delšího času zpracování vzorku.
• Vpravo: lze preferovat rychlost zpracování a čistotu, ale je nutné obětovat výtěžnost.

Phenomenex: Část 1 - Optimalizace separace

Než začnete, zvažte tyto otázky:

• Jaká je požadovaná konečná čistota produktu?
• Má být výsledný produkt ve specifické solné formě, v pevné fázi nebo v roztoku?
• Jak nejlépe vyvážit čas zpracování a výtěžnost?

Po jasném stanovení cílů je třeba vytvořit vhodnou analytickou metodu, která umožní vyhodnotit podmínky preparativní purifikace. Velmi často se nejdříve používá screeningová metoda, která umožňuje rychlé posouzení velkého počtu vzorků; klíčové výsledky jsou pak potvrzeny plnou analytickou metodou.

Během analytického screeningu se obvykle testuje více sad podmínek, aby bylo možné určit ty nejefektivnější pro preparativní měřítko. Níže je vidět příklad vlivu různých mobilních fází na separaci dvou těsně ležících píků, které jsou pro preparativní purifikaci klíčové.

Phenomenex: Vliv složení mobilní fáze na separaci dvou píků pro preparativní purifikaci

Důležitost správného zatížení kolony

U surových (crude) vzorků se mohou nečistoty nacházet velmi blízko cílového píku. I když je analyticky dosaženo požadované rozlišovací schopnosti, je nutné během vývoje metody určit, jak velké množství vzorku lze na kolonu aplikovat, aniž by došlo ke ztrátě rozlišení.

Níže je uveden příklad screeningu kolon pro liraglutid, kde byly za různých podmínek testovány čtyři stacionární fáze s cílem nalézt optimální separaci nečistot. Po dokončení screeningu můžete vybrat nejvhodnější separační podmínky pro scale-up (který bude popsán v technickém tipu č. 2).

Phenomenex: Kinetex C8 – porovnání různých rozpouštědel na separaci dvou píků

Phenomenex: Kinetex C18 – porovnání různých rozpouštědel na separaci dvou píků

Phenomenex: Kinetex fenyl-hexyl – porovnání různých rozpouštědel na separaci dvou píků

Preparativní chromatografie v kombinaci s UHPLC: Axia™ Packed Kinetex kolonami

Kinetex core-shell technologie v kombinaci s výkonností piston-packed preparativních kolon představuje ideální řešení pro vysokou účinnost a reprodukovatelnost při purifikacích ve velkém měřítku.

• Stáhněte si brožuru ZDE

Úvod do preparativní chromatografie

• Podívejte se na záznam webináře ZDE