Jak nejlépe přistoupit ke scale-upu analytické metody při jejím přenosu do preparativní chromatografie? Část druhá

Přehled

V preparativní chromatografii jsou tři klíčové parametry: produktivita, výtěžnost a čistota. Jejich vzájemné vyvážení určuje, jakým způsobem budete postupovat při scale-upu z analytické na preparativní HPLC. Toto je část 2 této technické série.

Připomeňte si část 1

Část 2: Kolik můžete skutečně naložit?

Zatížitelnost kolony (loadability) je pro preparativní chromatografisty zásadní parametr, protože přímo ovlivňuje průchodnost metody (throughput). Neexistuje však jednoduchá univerzální odpověď – přesto existuje několik způsobů, jak zatížitelnost stanovit.

Experimentální postup pro určení kapacity sorbentu spočívá v provedení loading studie za optimalizovaných analytických podmínek (získaných během vývoje metody). Následně se krokově zvyšuje množství vzorku, odebírají se frakce napříč píkem, který je středem zájmu a následně se hodnotí čistota získaných frakcí.

Phenomenex: Prep scale peptide flow

• A – typický chromatogram při analytickém měřítku
• B – zvýšené zatížení až na hranici dotýkajících se píků
• C – další navýšení způsobuje překryv pásů → ztráta čistoty nebo výtěžnosti

Teoretické stanovení zatížitelnosti

Pro ty, kteří chtějí provést teoretický výpočet, lze použít jednoduché pravidlo:

U správně optimalizované HPLC na reverzní fázi je minimální specifická zatížitelnost ~1 %.

• Vyjádřeno jako: g surového vzorku na 100 g stacionární fáze

U metod využívající normální fázi bývá zatížitelnost obvykle vyšší než u RP-HPLC. Tato obecná pravidla však nejsou absolutní, protože klíčové parametry separace – produktivita, výtěžnost a čistota – jsou vzájemně provázané a nelze maximalizovat všechny současně.

Skutečná zatížitelnost je tedy kompromisem mezi těmito třemi parametry.

Proto je nutné nejprve jasně definovat cíl purifikace a poté provést sérii měření při různých zatíženích a podmínkách sběru frakcí, abyste nalezli optimální nastavení.

Phenomenex: Prep scale peptide triangle

Doufáme, že pro vás byl tento technický tip užitečný. Sledujte nás pro další tipy, které vám pomohou zdokonalit vaše dovednosti v LC analýze!

Vývoj preparativní HPLC, scale-up a manipulace s preparativními kolonami

• Podívejte se na webinář ZDE.