Metody purifikace proteinů – klíčové techniky pro spolehlivé výsledky

Purifikace cílového proteinu je zásadní pro studium jeho specifických vlastností a interakcí s biomolekulami, jako jsou DNA, RNA a další proteiny. K dispozici je řada purifikačních strategií a optimální přístup závisí na faktorech, jako jsou požadovaný rozsah, kapacita zpracování vzorků a následná aplikace. V mnoha případech je nutné proces experimentálně optimalizovat, aby bylo dosaženo požadované čistoty a výtěžnosti.

Co je purifikace proteinů?

Purifikace proteinů je klíčový proces v biotechnologiích a biologických vědách, jehož cílem je izolovat konkrétní protein z komplexních biologických směsí, jako jsou buněčné lyzáty nebo tkáňové extrakty. Cílem je získat vysoce čistý vzorek proteinu bez kontaminujících látek, jako jsou jiné proteiny, nukleové kyseliny nebo lipidy, aby bylo možné přesně analyzovat jeho strukturu, funkci a interakce.

Tento proces je obzvláště důležitý v biotechnologických oblastech, jako jsou imunologie a mikrobiologie. V imunologii tvoří základ pro výrobu vakcín, terapeutických protilátek a diagnostických testů tím, že umožňuje izolaci klíčových imunitních proteinů a protilátek. Zároveň podporuje výzkum buněčné signalizace a mechanismů imunitní odpovědi. V mikrobiologii jsou purifikované proteiny nezbytné pro studium patogenů, identifikaci antigenů souvisejících s onemocněními a vývoj nových léčiv. Purifikace proteinů je tedy zásadní pro vývoj cílených vakcín, inovativních diagnostických metod a účinných terapeutických strategií.

Typy metod purifikace proteinů

Existuje několik typů metod purifikace proteinů, které se volí podle vlastností daného proteinu, například jeho velikosti, náboje, rozpustnosti nebo vazebné afinity. Níže jsou uvedeny některé běžně používané metody.

Nechromatografické metody

Nechromatografické metody využívají  k separaci a purifikaci proteinů jednodušší fyzikálně-chemické principy - rozpustnost, velikost molekul nebo difuzní vlastnosti. Tyto techniky se často používají jako počáteční kroky purifikace nebo koncentrace před dalšími navazujícími purifikačními kroky.

Precipitační techniky

Precipitace proteinů představuje široce používaný přístup v purifikačních postupech a obvykle využívá jednu ze tří hlavních metod:

• Precipitace organickými rozpouštědly spočívá v přídavku rozpouštědel, jako je ethanol nebo aceton, která snižují dielektrickou konstantu roztoku. Tím se podporují interakce mezi proteiny, snižuje se jejich rozpustnost a dochází k agregaci a precipitaci.
• Precipitace v izoelektrickém bodě využívá pH, při kterém protein nenese žádný výsledný náboj. V tomto bodě je jeho rozpustnost minimální, což vede k vysrážení proteinu z roztoku.
• Precipitace neiontovými polymery využívá polymery, jako jsou dextran, polyethylenglykol (PEG) nebo NPEP, které mění fyzikální vlastnosti roztoku. Tyto látky vytvářejí efekt molekulárního stěsnání, který podporuje agregaci proteinů, aniž by se na ně přímo vázaly.

Dialýza

Dialýza spočívá v umístění roztoku proteinu do polopropustné membrány, která propouští vodu a ionty, zatímco protein zůstává uvnitř. Tím je umožněna výměna pufru mezi vzorkem a okolním roztokem.

Tato metoda se běžně používá při expresi a purifikaci proteinů k výměně pufru, odsolení vzorku a odstranění nežádoucích nízkomolekulárních látek, jako jsou imidazol, močovina nebo síran amonný. Proces pomáhá zachovat stabilitu a biologickou aktivitu proteinu tím, že vzorek postupně převádí do požadovaných pufrových podmínek.

Immunocapture (purifikace pomocí magnetických částic)

Metoda immunocapture využívá protilátky imobilizované na pevných nosičích, například magnetických částicích, k selektivnímu záchytu a izolaci cílového proteinu. Tato metoda je vysoce specifická a je zvláště vhodná pro proteiny přítomné v nízkých koncentracích nebo pro zpracování menších objemů vzorků, například pro:

• Izolaci proteinů z komplexních směsí
• Záchyt značených rekombinantních proteinů (např. s FLAG, HA nebo His tagem)
• Obohacení vzorku před analýzou metodami Western blot, MS nebo ELISA.

Magnetické částice umožňují rychlou manipulaci, snadnou práci a minimální ztráty vzorku, což z nich činí ideální nástroj pro laboratorní purifikační postupy.

Biozen MagBeads představují rychlou a účinnou metodu pro purifikaci, izolaci a čištění monoklonálních protilátek (mAb), proteinů a peptidů. Tyto paramagnetické částice mají povrch potažený streptavidinem, který umožňuje vysokoafinitní vazbu v imunologických pracovních postupech. Ve srovnání s tradičními metodami přípravy vzorků nabízí imunoafinitní izolace pomocí magnetických částic vyšší rychlost a reprodukovatelnost díky vysoké vazebné kapacitě a jednotné velikosti částic. Výsledkem jsou pak přesné a spolehlivé výsledky dosažené v kratším čase.

Centrifugace

Centrifugace surových proteinových směsí je důležitou součástí purifikace proteinů i analýzy jejich agregace. Níže jsou popsány nejčastěji používané centrifugační techniky.

Preparativní ultracentrifugace
Ultracentrifugace je účinná metoda separace proteinů od agregátů na základě jejich velikosti, tvaru a hustoty. Tato robustní a univerzální technika se běžně používá k separaci komplexních směsí buněčných složek. Ultracentrifugy využívají vysoké odstředivé síly vznikající při velmi vysokých otáčkách, které umožňují oddělení částic podle jejich velikosti a hustoty.

Diferenciální centrifugace
Diferenciální centrifugace odděluje složky na základě rozdílů ve velikosti a hustotě pomocí postupně se zvyšujících rychlostí odstřeďování. Její rozlišovací schopnost je nízká až střední. Hlavní výhodou této metody je možnost současného zpracování většího počtu vzorků, což ji činí vhodnou pro hrubou separaci a předběžnou purifikaci biologických materiálů. V buněčných aplikacích navíc zachovává životaschopnost buněk a přirozené zastoupení hematopoetických buněčných populací.

Zonální centrifugace v hustotním gradientu
Tato technika odděluje složky podle jejich sedimentační rychlosti v prostředí s hustotním gradientem. Poskytuje střední rozlišovací schopnost a umožňuje přesnou separaci více složek v komplexních směsích. Díky své efektivitě a relativně nízkým nákladům patří mezi běžně používané techniky v molekulární biologii a biochemii.

Izopyknická (rovnovážná) centrifugace
Izopyknická centrifugace je pokročilá separační metoda založená na oddělování částic podle jejich vztlakové hustoty bez ohledu na jejich velikost nebo tvar. Během centrifugace migrují proteiny hustotním gradientem až do místa, kde se jejich hustota vyrovná hustotě okolního média. V této poloze dosáhnou rovnováhy a dále nesedimentují, což umožňuje velmi přesnou separaci jednotlivých složek.

Chromatografické metody

Chromatografie je běžně používaná metoda purifikace proteinů založená na separaci molekul ve směsi během jejich pohybu mezi stacionární a mobilní fází. Níže jsou uvedeny hlavní chromatografické techniky využívané při purifikaci proteinů.

Iontově výměnná chromatografie

Iontově výměnná chromatografie je založena na interakci mezi nabitou stacionární fází a opačně nabitými analyty. Například při kationtově výměnné chromatografii jsou kladně nabité molekuly přitahovány k záporně nabité stacionární fázi. Úspěšné použití této techniky vyžaduje pečlivý výběr vhodné iontoměničové kolony, pH pufru a koncentrace soli. V biofarmaceutickém průmyslu se tato metoda často využívá pro finální dočištění monoklonálních protilátek (mAb), odstranění virových kontaminantů a analýzu nábojových variant v rámci kontroly kvality produktu.

Společnost Phenomenex nabízí pro iontoměničovou chromatografii několik specializovaných kolon, například 

• Luna SCX pro vysoce selektivní separaci kladně nabitých sloučenin, například peptidů
• Biozen WCX pro separaci nábojových variant monoklonálních protilátek a dalších proteinů
• PhenoSphere SAX, silný aniontoměnič s plně porézními částicemi o velikosti pórů 80 Å, vhodný zejména pro malé molekuly, jako jsou nukleotidy

Vylučovací chromatografie

Vylučovací chromatografie (SEC) separuje molekuly na základě jejich velikosti. Větší analyty eluují jako první, protože jsou vyloučeny z pórů náplně kolony, zatímco menší molekuly do pórů vstupují, urazí delší dráhu a eluují později. Ve vodném prostředí se tato technika označuje jako gelová filtrační chromatografie (GFC) a používá se zejména pro analýzu biomolekul, jako jsou proteiny a protilátky. SEC je široce využívána jako analytický nástroj kontroly kvality v biofarmaceutickém průmyslu a často slouží také jako metoda pro finální dočištění produktů.

Společnost Phenomenex nabízí řadu kolon Biozen určených pro SEC separace. Pro aplikace zaměřené na monoklonální protilátky patří mezi nejvhodnější kolony Biozen dSEC-2 a Biozen dSEC-7, které umožňují separaci monomerů, agregátů a fragmentů vznikajících během výroby, zpracování nebo skladování mAb s vysokým rozlišením. Kolona dSEC-7 s větší velikostí pórů a optimalizovanou strukturou částic rozšiřuje dynamický rozsah metody a umožňuje analýzu větších biomolekul a komplexních bioterapeutik.

Pro obecnější aplikace pokrývají fáze Biozen SEC-2 a Biozen SEC-3 různé rozsahy molekulových hmotností a umožňují vysoce účinnou separaci biomolekul, například proteinů a protilátek. Pro preparativní separace jsou vhodnou volbou také kolony řad BioSep a Yarra.

Chromatografie na reverzní fázi

Chromatografie na reverzní fázi představuje nejrozšířenější separační režim v HPLC a UHPLC. Separace je založena na hydrofobních a van der Waalsových interakcích mezi analyty a alkylovými stacionárními fázemi (C18, C8, C4) nebo jinými hydrofobními polymery. Pro velké biomolekuly, jako jsou proteiny a peptidy, jsou ideální stacionární fáze C4, C8 a C18 s širokými póry (typicky 300 Å), protože větší velikost pórů umožňuje lepší přístup proteinových molekul k povrchu stacionární fáze, což zlepšuje přenos hmoty a tvar chromatografických píků.

Řada Biozen společnosti Phenomenex nabízí široké portfolio HPLC/UHPLC kolon pro analýzu biomolekul. Patří mezi ně fáze optimalizované pro analýzu intaktních proteinů s vysokým rozlišením (Native-RP, Widepore C4 a Intact XB-C8) i peptidů (Peptide PS-C18, Peptide XB-C18 a Peptide Polar-C18). Další možnost představují kolony řady Kinetex, které nabízejí odlišnou selektivitu pro analýzu peptidů a menších proteinů. Některé z těchto stacionárních fází jsou navíc dostupné také v provedení Phenomenex Axia, které umožňuje snadný přechod z analytického na preparativní měřítko.

Hydroxyapatitová chromatografie

Hydroxyapatitová chromatografie (HAC) je chromatografická technika se smíšeným separačním mechanismem, která využívá jedinečných vlastností hydroxyapatitu (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂). Separace je založena jak na iontově-výměnných interakcích prostřednictvím fosfátových skupin, tak na afinitních interakcích zprostředkovaných vápníkovými centry hydroxyapatitu, což umožňuje vysoce selektivní separaci proteinů.

HAC je zvláště účinná při separaci komplexních biomolekulárních směsí. Vyniká například při odstraňování agregátů z monoklonálních protilátek, kde často překonává možnosti tradičních chromatografických metod založených pouze na jednom separačním mechanismu, jako je iontoměničová chromatografie nebo hydrofobní interakční chromatografie (HIC).

Hydrofobní interakční chromatografie

Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) je metoda purifikace proteinů, která separuje molekuly na základě jejich hydrofobicity. Využívá pufry s vysokou koncentrací soli, které podporují hydrofobní interakce mezi proteiny a stacionární fází při současném zachování jejich biologické aktivity. Proces zahrnuje postupné snižování koncentrace soli, během něhož proteiny eluují v pořadí podle rostoucí hydrofobicity. Díky schopnosti účinně odstraňovat nečistoty a agregáty je HIC cenným nástrojem pro průběžné i finální kroky purifikace proteinů.

Afinitní chromatografie

Afinitní chromatografie je vysoce selektivní metoda purifikace biomolekul založená na specifických a reverzibilních interakcích mezi cílovou molekulou a imobilizovaným ligandem. Rekombinantní proteiny jsou často opatřeny afinitními tagy, například His tagem nebo GST tagem, které umožňují jejich vazbu na odpovídající ligandy imobilizované na chromatografické matrici.

Výhodou této metody je možnost dosáhnout několikatisícinásobného zvýšení čistoty v jediném kroku při zachování biologické aktivity proteinu. Afinitní chromatografie se široce využívá k purifikaci enzymů, protilátek a antigenů s využitím různých ligandů, včetně specifických protilátek, enzymů a multifunkčních sloučenin, jako jsou konkanavalin A nebo triazinová barviva.