Analýza a purifikace syntetických oligonukleotidů od začátku do konce. Od výzkumu a vývoje po produkční QA/QC

Syntetické oligonukleotidy jsou krátké řetězce RNA nebo DNA nejčastěji o počtu 15 až 100 jednotek nukleotidů. Mají široké využití v oblasti výzkumu, v genetice i ve forensních vědách. Tato skupina sloučenin zahrnuje i malé interferující RNA, terapeutické antisense oligonukleotidy, aptamery a CRISPR vodící RNA (CRISPR guide) (1). Tyto látky se vyrábějí synteticky, často s modifikací základní kostry nebo cukru na 2´pozici kvůli stabilitě a farmakologickým účinkům.

Syntéza oligonukleotidů je poměrně složitý proces, kdy při jednotlivých cyklech vzniká řada vedlejších produktů. Při vývoji a výrobě těchto látek je proto nezbytná podrobná charakterizace nečistot i cílového produktu a jeho purifikace. Charakterizace oligonukleotidů zahrnuje potvrzení jejich molekulové hmotnosti, sekvence nukleotidů, čistoty finálního oligonukleotidu a relativní kvantifikace specifických nečistot. V tomto článku se dozvíte, jaké nástroje nabízí společnost Agilent pro tuto oblast.

HPLC separace oligonukleotidů

Chromatografická separace oligonukleotidů se provádí metodami HPLC, nicméně samotná analýza skrývá řadu nástrah. Oligonukleotidy jsou poměrně polární a především obsahují mnoho záporně nabitých fosfátových funkčních skupin. Separace na běžné reverzní fázi není vhodná z důvodu malé retence. LC separace se proto provádí na silných anexech (SAX) ¹’² anebo pomocí iontopárové chromatografie na reverzní fázi (IP-RP) ³’⁴, s triethylaminem jako nejběžnějším iontově párovým činidlem, což je metoda potenciálně kompatibilní i s hmotnostně spektrometrickou detekcí.

Problémem je, že iontopárové činidlo zůstává dlouho v celém LC/MS systému a jeho použití není vhodné v laboratořích, kde je MS detektor využíván i pro jiné aplikace, především v režimu pozitivní ionizace. V nedávno publikovaných aplikačních poznámkách byla s úspěchem použita i separace na chromatografii s hydrofilní-lipofilní interakcí HILIC⁵’⁶, při které se iontopárové činidlo nepoužívá.

Přítomnost velmi polárních fosfátových skupin také vede k negativním sorpčním jevům v běžných HPLC systémech, které obsahují nerezové komponenty. Proto je vhodnější využívat (U)HPLC systémy z ušlechtilých slitin bez přítomnosti železa, které se označují jako biokompatibilní popř. bioinertní. Agilent pro tuto analýzu přímu doporučuje systém 1290 Infinity II Bio ve variantě UHPLC (1300 bar) nebo Prime (800 bar) a kolony série AdvanceBio.

Stanovení čistoty oligonukleotidů

Získání vysoce čistých syntetických oligonukleotidů není snadné. Platí, že s délkou řetězce cílové molekuly klesá výtěžnost výroby a zvyšuje se podíl nečistot. Nečistoty vzniklé při syntéze zahrnují molekuly s kratším nebo naopak delším nukleotidovým řetězcem, nekompletní thiolací, případně se ztrátou bází. K dalším nečistotám patří produkty konverze fosforothioátů na fosfodiestery, produkty oxidace, enzymové nukleázové degradace nebo nečistoty s přítomností chránících skupin, používaných ve výrobě.

Pro stanovení čistoty oligonukleotidů nabízí Agilent dvě ucelená řešení pomocí metod LC/UV nebo LC/MS, viz obrázek níže. Co se týče MS detektoru, je zde dostačující jednoduchý kvadrupól popřípadě TOF MS, který lze zároveň využít pro profilování nečistot diskutované v následujícím odstavci.

Altium: Agilent řešení pro analýzu oligonukleotidů

Potvrzení hmoty produktu a profilování nečistot

Podrobná charakterizace vzorku obnáší nejen potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu, ale také identifikaci a relativní kvantifikaci nečistot. Vzhledem k rozmanitosti potenciálních nečistot a jejich stopovému množství vůči hlavnímu produktu potřebujeme při profilování nečistot pokročilé analytické metody jako je LC/MS. Zároveň se v rutinní analýze neobejdeme bez pokročilých softwarových nástrojů pro automatické zpracování a interpretaci výsledků. Software Agilent MassHunter BioConfirm 12 umožňuje analýzu dat pro potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu a stanovení souvisejících nečistot (Target Plus Impurities, TPI). Tento postup využívá MS dat bez fragmentace, která lze měřit na jednoduchém TOF MS detektoru Agilent 6230B. Obrázek níže znázorňuje tento postup. Na dalším obrázku níže je ilustrace zobrazení výsledků této analýzy v software BioConfirm. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce ⁷.

Altium: Target Plus Impurities (TPI) analytický postup v MassHunter BioConfirm 12.0

Altium: Zobrazení výsledků Target Plus Impurities (TPI) analytického postupu v MassHunter BioConfirm 12.0

Konfirmace sekvence oligonukleotidu

Pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu se pro cílový oligonukleotid změří MS/MS data s vysokým rozlišením a přesnou hmotou systémem LC/QTOF MS. Software MassHunter BioConfirm 12 potom „namapuje“ tato MS/MS data na předpokládané fragmenty vypočtené z uživatelem zadané sekvence nukleotidů a odpoví na otázku, jak dobře se shoduje skutečná sekvence s tou předpokládanou (pokrytí sekvence, sequence coverage). To je možné díky tomu, že z oligonukleotidové sekvence mohou vznikat pouze určité typy fragmentů – viz Obrázek níže. Software BioConfirm vypočte sumární vzorce všech předpokládaných fragmentů z dané sekvence, tyto fragmenty potom cíleně hledá v MS/MS spektru a zobrazí jejich detekci na tzv. Fragment confirmation ladder - viz další obrázek níže. Na základě toho je kvantifikováno pokrytí sekvence (viz následující obrázek níže) a jsou zjištěny strukturní modifikace sekvence i v situaci, že celková molekulová hmotnost je identická. Postup pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu naleznete na schematu v Obrázku níže. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce⁸.

Altium: A) Nomenklatura fragmentace oligonukleotidů. B) Anotace oligonukleotidů (Fragment confirmation ladder). Barvy písmen reprezentují různé typy fragmentů identifikované a označené v MS/MS spektru-Nomenklatura-fragmentace-oligonukleotidu-B)-Anotace-oligonukleotidu.jpg)

Altium: Příklad LC/MS/MS spektra 20-meru and 21-meru RNA se zobrazením nalezených typů fragmentů

Altium: Analytický postup pro konfirmaci sekvence v MassHunter BioConfirm 12.0

Purifikace oligonukleotidů

Kromě portfolia pro analýzu oligonukleotidů nabízí Agilent také celé řešení pro jejich purifikaci. Uživatel může volit purifikační systém v širokém rozsahu od analytického měřítka až po preparativní. Kromě samotné instrumentace jsou k dispozici také kolony, software a hotové metody ⁹ˉ¹¹. Preparativní systémy jsou samozřejmě v bioinertním nebo biokompatibilním provedení jako Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert nebo 1290 Infinity II Bio LC.

[1] CRISPR je nedávno objevená technika genetického inženýrství, kterou lze modifikovat genomy živých organismů. Do buňky se dodá nukleasa Cas9 spojená se syntetickou vodicí RNA (gRNA) a genom buňky je možné štěpit na požadovaném místě.