LCMS
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.
Autor
Altium International
Je autorizovaným distributorem společnosti Agilent Technologies pro Českou republiku v oblastech chromatografie (GC, HPLC, UHPLC, kapilární elektroforéza) a hmotnostní spektrometrie (GC/MS, LC/MS, CE/MS), disolučních aparátů, molekulární (UV-Vis, UV-Vis-NIR, fluorescence, FTIR analyzátory a mikroskopy) a atomové spektroskopie (ICP-OES, ICP-MS, AAS), a v neposlední řadě také v oblasti molekulární biologie a genomiky (analýza nukleových kyselin a proteinů, microarray skenery a skla, PCR & RT-PCR, qPCR, řešení pro NGS, reagencie pro mutagenezi a klonování, sondy FISH a další).
Tagy
Článek
Aplikace
Produkt
Video
Logo of LinkedIn

Analýza a purifikace syntetických oligonukleotidů od začátku do konce. Od výzkumu a vývoje po produkční QA/QC

St, 8.11.2023
| Originální článek z: Altium International/Jitka Zrostlíková/Ondřej Lacina
Syntéza oligonukleotidů je poměrně složitý proces, pro jejich vývoj a výrobu je nezbytná charakterizace nečistot i cílového produktu a jeho purifikace.
Video placeholder
  • Foto: Altium: Analýza a purifikace syntetických oligonukleotidů od začátku do konce. Od výzkumu a vývoje po produkční QA/QC
  • Video: Agilent Technologies: Biopharmaceutical software for LC/MS oligonucleotide analysis

Syntetické oligonukleotidy jsou krátké řetězce RNA nebo DNA nejčastěji o počtu 15 až 100 jednotek nukleotidů. Mají široké využití v oblasti výzkumu, v genetice i ve forensních vědách. Tato skupina sloučenin zahrnuje i malé interferující RNA, terapeutické antisense oligonukleotidy, aptamery a CRISPR vodící RNA (CRISPR guide) (1). Tyto látky se vyrábějí synteticky, často s modifikací základní kostry nebo cukru na 2´pozici kvůli stabilitě a farmakologickým účinkům.

Syntéza oligonukleotidů je poměrně složitý proces, kdy při jednotlivých cyklech vzniká řada vedlejších produktů. Při vývoji a výrobě těchto látek je proto nezbytná podrobná charakterizace nečistot i cílového produktu a jeho purifikace. Charakterizace oligonukleotidů zahrnuje potvrzení jejich molekulové hmotnosti, sekvence nukleotidů, čistoty finálního oligonukleotidu a relativní kvantifikace specifických nečistot. V tomto článku se dozvíte, jaké nástroje nabízí společnost Agilent pro tuto oblast.

HPLC separace oligonukleotidů

Chromatografická separace oligonukleotidů se provádí metodami HPLC, nicméně samotná analýza skrývá řadu nástrah. Oligonukleotidy jsou poměrně polární a především obsahují mnoho záporně nabitých fosfátových funkčních skupin. Separace na běžné reverzní fázi není vhodná z důvodu malé retence. LC separace se proto provádí na silných anexech (SAX) ¹’² anebo pomocí iontopárové chromatografie na reverzní fázi (IP-RP) ³’⁴, s triethylaminem jako nejběžnějším iontově párovým činidlem, což je metoda potenciálně kompatibilní i s hmotnostně spektrometrickou detekcí.

Problémem je, že iontopárové činidlo zůstává dlouho v celém LC/MS systému a jeho použití není vhodné v laboratořích, kde je MS detektor využíván i pro jiné aplikace, především v režimu pozitivní ionizace. V nedávno publikovaných aplikačních poznámkách byla s úspěchem použita i separace na chromatografii s hydrofilní-lipofilní interakcí HILIC⁵’⁶, při které se iontopárové činidlo nepoužívá.

Přítomnost velmi polárních fosfátových skupin také vede k negativním sorpčním jevům v běžných HPLC systémech, které obsahují nerezové komponenty. Proto je vhodnější využívat (U)HPLC systémy z ušlechtilých slitin bez přítomnosti železa, které se označují jako biokompatibilní popř. bioinertní. Agilent pro tuto analýzu přímu doporučuje systém 1290 Infinity II Bio ve variantě UHPLC (1300 bar) nebo Prime (800 bar) a kolony série AdvanceBio.

Stanovení čistoty oligonukleotidů

Získání vysoce čistých syntetických oligonukleotidů není snadné. Platí, že s délkou řetězce cílové molekuly klesá výtěžnost výroby a zvyšuje se podíl nečistot. Nečistoty vzniklé při syntéze zahrnují molekuly s kratším nebo naopak delším nukleotidovým řetězcem, nekompletní thiolací, případně se ztrátou bází. K dalším nečistotám patří produkty konverze fosforothioátů na fosfodiestery, produkty oxidace, enzymové nukleázové degradace nebo nečistoty s přítomností chránících skupin, používaných ve výrobě.

Pro stanovení čistoty oligonukleotidů nabízí Agilent dvě ucelená řešení pomocí metod LC/UV nebo LC/MS, viz obrázek níže. Co se týče MS detektoru, je zde dostačující jednoduchý kvadrupól popřípadě TOF MS, který lze zároveň využít pro profilování nečistot diskutované v následujícím odstavci.

Altium: Agilent řešení pro analýzu oligonukleotidů

Potvrzení hmoty produktu a profilování nečistot

Podrobná charakterizace vzorku obnáší nejen potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu, ale také identifikaci a relativní kvantifikaci nečistot. Vzhledem k rozmanitosti potenciálních nečistot a jejich stopovému množství vůči hlavnímu produktu potřebujeme při profilování nečistot pokročilé analytické metody jako je LC/MS. Zároveň se v rutinní analýze neobejdeme bez pokročilých softwarových nástrojů pro automatické zpracování a interpretaci výsledků. Software Agilent MassHunter BioConfirm 12 umožňuje analýzu dat pro potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu a stanovení souvisejících nečistot (Target Plus Impurities, TPI). Tento postup využívá MS dat bez fragmentace, která lze měřit na jednoduchém TOF MS detektoru Agilent 6230B. Obrázek níže znázorňuje tento postup. Na dalším obrázku níže je ilustrace zobrazení výsledků této analýzy v software BioConfirm. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce ⁷.

Altium: Target Plus Impurities (TPI) analytický postup v MassHunter BioConfirm 12.0

Altium: Zobrazení výsledků Target Plus Impurities (TPI) analytického postupu v MassHunter BioConfirm 12.0

Konfirmace sekvence oligonukleotidu

Pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu se pro cílový oligonukleotid změří MS/MS data s vysokým rozlišením a přesnou hmotou systémem LC/QTOF MS. Software MassHunter BioConfirm 12 potom „namapuje“ tato MS/MS data na předpokládané fragmenty vypočtené z uživatelem zadané sekvence nukleotidů a odpoví na otázku, jak dobře se shoduje skutečná sekvence s tou předpokládanou (pokrytí sekvence, sequence coverage). To je možné díky tomu, že z oligonukleotidové sekvence mohou vznikat pouze určité typy fragmentů – viz Obrázek níže. Software BioConfirm vypočte sumární vzorce všech předpokládaných fragmentů z dané sekvence, tyto fragmenty potom cíleně hledá v MS/MS spektru a zobrazí jejich detekci na tzv. Fragment confirmation ladder - viz další obrázek níže. Na základě toho je kvantifikováno pokrytí sekvence (viz následující obrázek níže) a jsou zjištěny strukturní modifikace sekvence i v situaci, že celková molekulová hmotnost je identická. Postup pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu naleznete na schematu v Obrázku níže. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce⁸.

Altium: A) Nomenklatura fragmentace oligonukleotidů. B) Anotace oligonukleotidů (Fragment confirmation ladder). Barvy písmen reprezentují různé typy fragmentů identifikované a označené v MS/MS spektru-Nomenklatura-fragmentace-oligonukleotidu-B)-Anotace-oligonukleotidu.jpg)

Altium: Příklad LC/MS/MS spektra 20-meru and 21-meru RNA se zobrazením nalezených typů fragmentů

Altium: Analytický postup pro konfirmaci sekvence v MassHunter BioConfirm 12.0

Purifikace oligonukleotidů

Kromě portfolia pro analýzu oligonukleotidů nabízí Agilent také celé řešení pro jejich purifikaci. Uživatel může volit purifikační systém v širokém rozsahu od analytického měřítka až po preparativní. Kromě samotné instrumentace jsou k dispozici také kolony, software a hotové metody ⁹ˉ¹¹. Preparativní systémy jsou samozřejmě v bioinertním nebo biokompatibilním provedení jako Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert nebo 1290 Infinity II Bio LC.

[1] CRISPR je nedávno objevená technika genetického inženýrství, kterou lze modifikovat genomy živých organismů. Do buňky se dodá nukleasa Cas9 spojená se syntetickou vodicí RNA (gRNA) a genom buňky je možné štěpit na požadovaném místě.

Zdroje
  1. Jordy Hsiao et al.: Optimizing Separation of Oligonucleotides with Anion‑Exchange Chromatography, Agilent aplikační poznámka 2022

  2. J. Massi et al.: High Resolution Separations of Oligonucleotides using PL-SAX Strong Anion-Exchange HPLC Columns, Agilent aplikační poznámka 2021

  3. Phu Duong et al.: Fast and High-Resolution Reversed-Phase Separation of Synthetic Oligonucleotides, Agilent aplikační poznámka 2017

  4. Gerd Vanhoenacker et al.: Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides, Agilent aplikační poznámka 2021

  5. Peter Rye et al.: MS1 Oligonucleotide Characterization Using LC/Q-TOF with HILIC Chromatography, Agilent aplikační poznámka 2023

  6. Guannan Li et al.: MS/MS Oligonucleotide Sequencing Using LC/Q-TOF with HILIC Chromatography, Agilent aplikační poznámka 2023

  7. David L. Wong et al.: An Integrated Workflow for the Analysis of Oligonucleotides and Their Impurities by Agilent High-Resolution LC/(Q-)TOF Mass Spectrometry Separation, characterization, and relative quantitation of target oligonucleotides and their impurities, Agilent aplikační poznámka 2022

  8. David L. Wong et al.: Comprehensive and Integrated Workflow for Oligonucleotide Sequence Confirmation by Agilent High-Resolution LC/Q-TOF, Agilent aplikační poznámka 2022

  9. Florian Rieck et al.: Fast and Selective Purification of Oligonucleotides Using Preparative HPLC/MS and Software Support, Agilent aplikační poznámka 2022

  10. Oligonucleotide Purification using Ion Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography, Agilent Consumables Workflow Ordering Guide

  11. Oligonucleotide Purification using Anion Exchange Liquid Chromatography, Agilent Consumables Workflow Ordering Guide

Altium International
 

Mohlo by Vás zajímat

Analysis of Per- and Polyfluoroalkyl Substances in Fast Food Packaging by LC-MS/MS Method

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Watrex product catalog 2024

Brožury a specifikace
| 2024 | Watrex Praha
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC, Příprava vzorků, LC kolony, Spotřební materiál
Výrobce
Watrex Praha
Zaměření
Ostatní

IMPACT OF HPLC INSTRUMENTATION ON NON- SPECIFIC ADSORPTION OF PEPTIDES

Postery
| 2024 | Waters (Analytica)
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Determination of Nitrosamine Impurities and NDSRI in Anti-diabetic Drugs on Shimadzu LCMS-8060NX

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Ostatní
| 2024 | ALS Czech Republic
Instrumentace
LC/MS, GC/MSD
Výrobce
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články


Článek | Produkt

Představujeme: Revoluční platformu iontových chromatografů Thermo Scientific™ Dionex™ Inuvion™ z pohledu aplikací!

Systém Thermo Scientific Dionex Inuvion si můžete nakonfigurovat tak, aby vyhovoval konkrétním analytickým a finančním požadavkům, a podle potřeby jej snadno rekonfigurovat.
Pragolab
more

Článek | Nejbližší akce

Pozvánka na Laborexpo - stánek SHIMADZU

Přijďte se podívat na stánek SHIMADZU v rámci veletrhu LABOREXPO ve dnech 5. a 6. června. Jaké přístroje nebo program pro Vás na stánku č. C29 připravujeme?
SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka
more

Článek | Produkt

Altium: Akční nabídka květen - srpen 2024

Akční nabídka květen - srpen 2024 od Altium International. Se slevou 30 % si můžete pořídit HPLC kolony, GC kolony, produkty pro úpravu vzorku, různé typy vialek, AdvanceBio Spin Columns, stříkačky.
Altium International
more

Článek | Nejbližší akce

Přednáška LABOREXPO 2024: Spektrofotometry NanoDrop: precizní analýza vzorků proteinů a DNA v mikroobjemech (M.G.P.)

Zveme Vás na přednášku Martina Kuthana (M.G.P. spol. s r.o.) Spektrofotometry NanoDrop: precizní analýza vzorků proteinů a DNA v mikroobjemech, ve čtvrtek 6. 6. v čase 11:30 - 11:50 hod.
LabRulez
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Analysis of Per- and Polyfluoroalkyl Substances in Fast Food Packaging by LC-MS/MS Method

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Watrex product catalog 2024

Brožury a specifikace
| 2024 | Watrex Praha
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC, Příprava vzorků, LC kolony, Spotřební materiál
Výrobce
Watrex Praha
Zaměření
Ostatní

IMPACT OF HPLC INSTRUMENTATION ON NON- SPECIFIC ADSORPTION OF PEPTIDES

Postery
| 2024 | Waters (Analytica)
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Determination of Nitrosamine Impurities and NDSRI in Anti-diabetic Drugs on Shimadzu LCMS-8060NX

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Ostatní
| 2024 | ALS Czech Republic
Instrumentace
LC/MS, GC/MSD
Výrobce
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články


Článek | Produkt

Představujeme: Revoluční platformu iontových chromatografů Thermo Scientific™ Dionex™ Inuvion™ z pohledu aplikací!

Systém Thermo Scientific Dionex Inuvion si můžete nakonfigurovat tak, aby vyhovoval konkrétním analytickým a finančním požadavkům, a podle potřeby jej snadno rekonfigurovat.
Pragolab
more

Článek | Nejbližší akce

Pozvánka na Laborexpo - stánek SHIMADZU

Přijďte se podívat na stánek SHIMADZU v rámci veletrhu LABOREXPO ve dnech 5. a 6. června. Jaké přístroje nebo program pro Vás na stánku č. C29 připravujeme?
SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka
more

Článek | Produkt

Altium: Akční nabídka květen - srpen 2024

Akční nabídka květen - srpen 2024 od Altium International. Se slevou 30 % si můžete pořídit HPLC kolony, GC kolony, produkty pro úpravu vzorku, různé typy vialek, AdvanceBio Spin Columns, stříkačky.
Altium International
more

Článek | Nejbližší akce

Přednáška LABOREXPO 2024: Spektrofotometry NanoDrop: precizní analýza vzorků proteinů a DNA v mikroobjemech (M.G.P.)

Zveme Vás na přednášku Martina Kuthana (M.G.P. spol. s r.o.) Spektrofotometry NanoDrop: precizní analýza vzorků proteinů a DNA v mikroobjemech, ve čtvrtek 6. 6. v čase 11:30 - 11:50 hod.
LabRulez
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Analysis of Per- and Polyfluoroalkyl Substances in Fast Food Packaging by LC-MS/MS Method

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Watrex product catalog 2024

Brožury a specifikace
| 2024 | Watrex Praha
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC, Příprava vzorků, LC kolony, Spotřební materiál
Výrobce
Watrex Praha
Zaměření
Ostatní

IMPACT OF HPLC INSTRUMENTATION ON NON- SPECIFIC ADSORPTION OF PEPTIDES

Postery
| 2024 | Waters (Analytica)
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Determination of Nitrosamine Impurities and NDSRI in Anti-diabetic Drugs on Shimadzu LCMS-8060NX

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Ostatní
| 2024 | ALS Czech Republic
Instrumentace
LC/MS, GC/MSD
Výrobce
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články


Článek | Produkt

Představujeme: Revoluční platformu iontových chromatografů Thermo Scientific™ Dionex™ Inuvion™ z pohledu aplikací!

Systém Thermo Scientific Dionex Inuvion si můžete nakonfigurovat tak, aby vyhovoval konkrétním analytickým a finančním požadavkům, a podle potřeby jej snadno rekonfigurovat.
Pragolab
more

Článek | Nejbližší akce

Pozvánka na Laborexpo - stánek SHIMADZU

Přijďte se podívat na stánek SHIMADZU v rámci veletrhu LABOREXPO ve dnech 5. a 6. června. Jaké přístroje nebo program pro Vás na stánku č. C29 připravujeme?
SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka
more

Článek | Produkt

Altium: Akční nabídka květen - srpen 2024

Akční nabídka květen - srpen 2024 od Altium International. Se slevou 30 % si můžete pořídit HPLC kolony, GC kolony, produkty pro úpravu vzorku, různé typy vialek, AdvanceBio Spin Columns, stříkačky.
Altium International
more

Článek | Nejbližší akce

Přednáška LABOREXPO 2024: Spektrofotometry NanoDrop: precizní analýza vzorků proteinů a DNA v mikroobjemech (M.G.P.)

Zveme Vás na přednášku Martina Kuthana (M.G.P. spol. s r.o.) Spektrofotometry NanoDrop: precizní analýza vzorků proteinů a DNA v mikroobjemech, ve čtvrtek 6. 6. v čase 11:30 - 11:50 hod.
LabRulez
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Analysis of Per- and Polyfluoroalkyl Substances in Fast Food Packaging by LC-MS/MS Method

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Watrex product catalog 2024

Brožury a specifikace
| 2024 | Watrex Praha
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC, Příprava vzorků, LC kolony, Spotřební materiál
Výrobce
Watrex Praha
Zaměření
Ostatní

IMPACT OF HPLC INSTRUMENTATION ON NON- SPECIFIC ADSORPTION OF PEPTIDES

Postery
| 2024 | Waters (Analytica)
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Determination of Nitrosamine Impurities and NDSRI in Anti-diabetic Drugs on Shimadzu LCMS-8060NX

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Ochrana zdrojů pitných vod: Inovativní řešení problematiky výskytu pesticidů v krajině

Ostatní
| 2024 | ALS Czech Republic
Instrumentace
LC/MS, GC/MSD
Výrobce
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články


Článek | Produkt

Představujeme: Revoluční platformu iontových chromatografů Thermo Scientific™ Dionex™ Inuvion™ z pohledu aplikací!

Systém Thermo Scientific Dionex Inuvion si můžete nakonfigurovat tak, aby vyhovoval konkrétním analytickým a finančním požadavkům, a podle potřeby jej snadno rekonfigurovat.
Pragolab
more

Článek | Nejbližší akce

Pozvánka na Laborexpo - stánek SHIMADZU

Přijďte se podívat na stánek SHIMADZU v rámci veletrhu LABOREXPO ve dnech 5. a 6. června. Jaké přístroje nebo program pro Vás na stánku č. C29 připravujeme?
SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka
more

Článek | Produkt

Altium: Akční nabídka květen - srpen 2024

Akční nabídka květen - srpen 2024 od Altium International. Se slevou 30 % si můžete pořídit HPLC kolony, GC kolony, produkty pro úpravu vzorku, různé typy vialek, AdvanceBio Spin Columns, stříkačky.
Altium International
more

Článek | Nejbližší akce

Přednáška LABOREXPO 2024: Spektrofotometry NanoDrop: precizní analýza vzorků proteinů a DNA v mikroobjemech (M.G.P.)

Zveme Vás na přednášku Martina Kuthana (M.G.P. spol. s r.o.) Spektrofotometry NanoDrop: precizní analýza vzorků proteinů a DNA v mikroobjemech, ve čtvrtek 6. 6. v čase 11:30 - 11:50 hod.
LabRulez
more
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.