Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích v extrémních oblastech pH

U běžných typů kolon na reverzních fázích se rozmezí pH pohybuje od 2 do 8. Při použití fosfátových pufrů pH 8 na normálních i reverzních fázích, zejména v kombinaci za vyšší teploty však dochází k výraznému snížení životnosti kolony – dochází k rozpouštění nosiče - většinou silikagelu tak jak je ukázáno na obrázku níže. Pro vysoké teploty je před fosfátovými pufry preferován pufr TRIS - Tris(hydroxymethyl)-aminomethan a pracovní pH 7.

HPLC. cz: Rozpouštění nosiče stacionární fáze v HPLC koloně

1. Při pH < 2,5

• dochází k hydrolýze silikagelu
• což se projevuje snížením retenčního času
• dochází ke snižování životnosti kolony

V tomto případě je lepší použití polymerních kolon nebo speciálních kolon určených k tomuto účelu (např. Xterra, ZORBAX Extend-C18).

2. Při pH > 7,0

• se silikagel začíná již rozpouštět
• dochází ke snížení účinnosti kolony (vlivem zvýšení mrtvého objemu kolony)
• dochází ke snížení retenčního času
• zpětný tlak na koloně vzrůstá

V tomto případě je lepší použití polymerních kolon jak již bylo uvedeno výše. V případě, že není polymerní kolonu možné použít (např. z důvodu nižší účinnosti) je možné použít tzv. presaturační kolonu k prodloužení životnosti analytické kolony. Presaturační kolona (Pre-Sat) se zařazuje mezi HPLC pumpu a nástřikové zařízení:

HPLC. cz: Použití presaturační kolony

Poněvadž je mobilní fáze pak saturována silikagelem, který se uvolňuje z presaturační kolony, rozpouštění silikagelu v analytické koloně je sníženo na minimum.

3. Při pH < 2 a pH > 8

Nejlepší řešení separace v těchnto oblastech je použití polymerních fází, které jsou většinou kompatibilní v celém rozsahu pH.

Nevýhodou polymerních fází je, že částečky obsahují mikropóry o velikosti asi 1 nm, což zabraňuje přenosu hmoty zejména malých molekul.

Polymerní stacionární fáze jsou dále omezeny maximálním pracovním tlakem na koloně a to 20 MPa i když 10 MPa je pro většinu aplikací HPLC dostačující.

Stabilita polymerních stacionárních fází je omezena stabilitou funkčních skupin polymeru – pro methylakrylát je limitující stabilita esterové skupiny, pro akrylamid je limitující stabilita amidové skupiny. I když současně připravované polymerní fáze jsou dostatečně mechanicky i chemicky stálé, pro jejich nižší účinnost dosud nevytlačily z použití chemicky vázané nepolární stacionární fáze.

Styrendivinylbenzen byl použit jako stacionární fáze v iontově-výměnné chromatografii dávno před použitím v HPLC. Ve srovnání s chemicky vázanou fází C18 je retence na styrendivinylbenzenu vyšší a k dosažení rozumných retenčních časů je nutné zvýšit obsah organického rozpouštědla v mobilní fázi. Toto zvýšení retence je vysvětlováno specifickými interakcemi analytu s p-elektrony stacionární fáze, ale toto vysvětlení není příliš korektní, protože neplatí pro fenylovou fázi, která by měla vykazovat obdobné zvýšení retence. Lepší vysvětlení je zvýšení specifického povrchu nosiče a tím i fázového poměru a distribuční konstanty.

Styrendivinylbenzenová fáze je stabilní v rozsahu pH 0 až 14, nejčastější použití je analýza proteinů a peptidů, kdy pro tyto druhy analytů nehraje významnou roli mikroporosita náplně a chromatografická účinnost je srovnatelná s chemicky vázanou fází C18.

4. Porézní grafitovaný uhlík

Je používán od roku 1988, kdy byl uveden na trh. (1, 2) Jeho velkou výhodou je stabilita v oblasti pH 1 - 14, stabilita tlaková je do 40 MPa.

Při porovnání retence hydrofobních látek na uhlíkových sorbentech a sorbentech typu alkylsilikagelů, se uhlíkový sorbent vyznačuje o něco vyšší afinitou, u aromatických a polárních látek je tato afinita daleko vyšší. Toto je vysvětlováno přítomností delokalizovaných p-elektronů na povrchu uhlíkového sorbentu a dochází tak ke specifickým interakcím sorbent-solut. (3) Kromě toho jsou často pozorovány na uhlíkovém sorbentu chvostující píky, které indikují heterogenitu povrchu sorbentu. Přítomnost fixních adsorpčních center na povrchu sorbentu zajišťuje vyšší selektivitu sorbentu k dělení polohových isomerů. (4)

Výhodou uhlíkových sorbentů je možnost změny retence bazických látek změnou pH mobilní fáze a to, že chování těchto látek na tomto sorbentu se dá daleko více předpovídat než na sorbentech typu alkylsilikagelů, které obsahují zbytkové silanolové skupiny a jsou omezeny rozpustností silikagelu v alkalických oblastech pH.

5. HPLC kolony na bázi oxidů kovů

Rozpustnost silikagelu při vyšším pH mobilní fáze vedlo k vývoji alternativních HPLC kolon na bázi oxidů kovů (oxidu titaničitého, oxidu hlinitého), ale zejména (oxidu zirkoničitého).

Retence polárních látek v reverzním módu

Retence polárních látek v reverzním módu je velmi malá a velmi polární látky eluuje v mrtvém objemu kolony. Zvýšení retence na reverzních fázích je možné několikerým způsobem.

Zůstaneme-li na klasických reverzních fázích např. C18 pak je nutné potlačit ionizaci polárních látek a snížit pak objemový zlomek organického modifikátoru v mobilní fázi. Pak se však pracuje již se 100 % vodnými fázemi a doporučují se speciální kolony (např. Synergie Hydro-RP).

Druhý způsob je použití iontové párové chromatografie.

Třetí a nejúčinnější způsob je přechod na jiný typ stacionární fáze. Může se použít způsobu, kdy se do alkylového ligandu včlení polární skupina (amid nebo karbanit – kolony Supelco RP-Amide C16 nebo Waters Symmetry Shield) a nebo se použije zcela jiná stacionární fáze nap. fenylová nebo propylaminová. Každá z obou uvedených fází má své výhody i nevýhody.

Fenylová fáze

Tato fáze je polárnější než kalsická fáze C18. Jako mobilní fáze se upřednostňuje mobilní fáze s methanolem v rozmezí pH 1,5 - 7,0 (při použití acetonitrilu dochází k p-p interakcím stacionární fáze fenylu s volnými p-elektrony nitrilové skupiny). Na této fázi dochází ke zvýšení retence polárních látek, zvýšení účinnosti (zlepší /zúží/ se tvar píku) a fáze je selektivnější pro aromatické analyty (právě díky p-p interakcím). Jako příklad je možné uvést kolonu Synergie Polar-RP.

Propylaminová fáze

Komerčně používaný aminopropyl je připravován z trimethoxy nebo triethoxyaminopropylsilanu a jeho struktura je následující.

Retence na aminopropylu je ve srovnání silikagelu a aluminy vyšší a dobře je může substituovat. Jak můžeme očekávat, retence látek kyselé povahy na aminopropylu je daleko větší než na silikagelu, kyanopropylu nebo diolu. Jako příklad je možno uvést separaci steroidů s fenolickou funkční skupinou, které jsou na této fázi daleko více zadržovány než na silikagelu. (5)

Nevýhodou aminopropylu je jeho vysoká reaktivita a může reagovat s aldehydy nebo ketony za vzniku iminů, nebo může být funkční skupina NH₂ oxidována např. peroxidy. V přítomnosti vody dochází k částečné hydrolýze NH₂ skupiny a výsledkem je vysoké alkalické prostředí v pórech, které se může pohybovat až kolem hodnoty pH 10 a vyšší a dochází k rozpouštění silikagelu.

V tomto případě i při dostatečně dlouhé ekvilibraci kolony se nedosáhne úplné regenerace a takto ekvilibrovaná fáze není srovnatelné s originální fází. Proto je nutné se vyhnout promývání aminopropylové fáze vodou Luna NH2 (Amino).

Vliv aktivity zbytkových silanolových skupin na reverzních fázích

I nejlépe připravená chemicky vázaná stacionární fáze obsahuje zbytkové polární silanolové skupiny jejichž obsah se pohybuje kolem 4 mmol/m² a typický obsah ligandových skupin se pohybuje někde kolem 3,5 £ mmol/m², tím pádem obsahuje více „residuálních“ silanolových skupin než ligandů.

Ačkoli většina těchto silanolových skupin není stéricky dostupná chromatografovaných látkám, jsou ještě dostatečně přístupné pro interakce s analytem a mobilní fází (vodíkové vazby, dipól-dipólové interakce, iontově-výměnné) a toto je potom příčinou stoupající retence a chvostování píků polárních, zejména bazických látek.

Iontově-výměnné reakce zbytkových silanolových skupin jsou dominující pro interakce s bazickými látkami a jsou funkcí pH mobilní fáze. Se stoupajícím pH mobilní fáze roste vliv zbytkových silanolových skupin, protože roste jejich počet s negativním nábojem (pH 6-8). Proto se v praxi používá eliminace nepolární fáze tj. minimalizování interakce bazických látek s volnými silanolovými skupinami (a tím minimalizace tailování píků) a tím i nutnost zvyšování obsahu chemicky vázaného uhlíku v nepolární fázi (carbon load). Existuje několik způsobů eliminace, které budou popsány dále.

Endcapping

Endcapping je fyzikálně-chemický proces, který redukuje počet volných silanolových skupin na nepolární fázi (na bázi silica) chemickou reakcí např. s trialkylchlorsilanem (alkyl - methyl). Trimethylchlorsilan jako menší molekula než trioktadecylchlrosilan pokryje stéricky bráněné volné silanolové skupiny (obrázek).

HPLC.cz: Grafické znázornění endcappingu

Stérické stínění volných OH skupin

Eliminace silanolových skupin stérickým odstíněním při přípravě chemicky vázaných fází, tj. přípravou fází s delším organickým uhlíkovým řetězcem a zvýšením obsahu vázaného uhlíku v nepolární fázi (carbon load), s tímto však současně roste i retence látek. Dokonalé stérické odstínění zbytkových -OH skupin lze docílit použitím objemných alkyl substituentů R1, R3 - diisobutyl nebo diisopropyl. Jako příklad lze uvést stacionární fázi Zorbax StableBond (Agilent, USA):

HPLC.cz: Stérické stínění volných OH skupin

Výhodou těchto stacionárních fází je vysoká stabilita vůči nízkým pH mobilní fáze (~1) a mobilní fázím obsahující trifluoroctovou kyselinu, je stabilní při teplotě až 90 °C a při použití 100 % vodné mobilní fáze nedochází ke kolapsu této fáze.

Modifikace ligandu

Začleněním polární skupiny do organického uhlíkového řetězce stacionární fáze mezi povrch silikagelu a nepolární vrstvy (ligand) např. karbamátové skupiny - reverzní fáze Symmetry Shield RP8 nebo Supelcosil ABZ Plus:

HPLC.cz: Modifikace ligandu

Tento krok zmírňuje interakci analytu s povrchovými volnými silanolovými skupinami, zejména bazických polárních látek. Pravděpodobně dochází k interakci mírně polární skupiny s volnými silanolovými skupinami a zvýšením polarity nepolární fáze dochází ke zvyšující se adsorpci vody v mobilní fázi.

pH a složení mobilní fáze

Z popisu chování silanolových skupin k mobilní fázi je zřejmé, že tyto můžeme eliminovat i úpravou pH mobilní fáze a to přídavkem organických aminů do mobilní fáze. Ty soutěží s analytem o aktivní centra zbytkových silanolových skupin a eliminují tak jejich chování. Nejčastěji se používá triethylamin, pokud je triethylamin nedostačující, používá se trioctylamin nebo cetyltrimethylamonná sůl.

Použití cetyltriethylaminu je velmi efektivní, ale prodlužuje se doba ekvilibrace kolony a retenční čas chromatografovaných látek. pH takto připravené mobilní fáze se musí upravit na hodnotu pH 2-7, jinak dochází k rozpouštění silikagelu. Jako přídavek se používá kyselina fosforečná, octová nebo citronová, u cetyltrimethylamonné soli se pH upravovat nemusí. Model je graficky zobrazen na obrázku.

HPLC.cz: Eliminace volných silanolových skupin přídavkem organického aminu do mobilní fáze

Z komerčně dostupných náplní s chemicky vázanými fázemi lze uvést nepolární fáze s alkylovými řetězci různé délky (C2-C18), s fenylovými a difenylovými skupinami, které mají zvýšenou polaritu a rozdílnou selektivitu zejména k fenolům a aminosloučeninám. Střední polaritou se vyznačují fáze nitrilové (alkylnitrily) a amidové, které se vykazují zvýšenou selektivitou k fenolům, cukrům a alkoholům. Aminové fáze mají slabé vlastnosti iontoměniče (anexu).

Polymerní stacionární fáze

Hlavní a podstatnou nevýhodou chemicky modifikovaného silikagelu je jeho rozpustnost v alkalické oblasti pH a mnoho chromatografických systémů by rádo upřednostnilo alkalickou oblast pH zejména pro separaci bazických látek. Tomuto požadavku vyhovují polymerní stacionární fáze, které jsou většinou kompatibilní v celém rozsahu pH.

Nevýhodou polymerních fází je, že částečky obsahují mikropóry o velikosti asi 1 nm, což zabraňuje přenosu hmoty zejména pro malé molekuly. Polymerní stacionární fáze jsou dále omezeny maximálním pracovním tlakem na koloně a to 20 MPa i když 10 MPa je pro většinu aplikací HPLC dostačující.

Stabilita polymerních stacionárních fází je omezena stabilitou funkčních skupin polymeru – pro methylakrylát je limitující stabilita esterové skupiny, pro akrylamid je limitující stabilita amidové skupiny. I když současně připravované polymerní fáze jsou dostatečně mechanicky i chemicky stálé, pro jejich nižší účinnost dosud nevytlačily z použití chemicky vázané nepolární stacionární fáze.