Odhalení skrytého potenciálu (SFC)

Víctor Cutillas a tým analytických chemiků na univerzitě v Almeríi ve Španělsku používali k analýze reziduí pesticidů v ovoci a zelenině konvenční standardní metodu. V časovém zájmu tým používal také sekundární, „záložní“ metodu. V průběhu práce si však tým uvědomil, jak dobře funguje sekundární metoda. Byla snad ještě výkonnější než primární metoda? Víctor Cutillas se rozhodl, že na tuto otázku musí znát odpověď. Pustil se tedy do srovnávacího výzkumu obou systémů.

Víctor Cutillas analyzuje rezidua pesticidů v Referenční laboratoři EU pro rezidua pesticidů v ovoci a zelenině (EURL-FV) na univerzitě v Almeríi ve Španělsku. Analýza reziduí pesticidů má zásadní význam pro zajištění bezpečnosti potravin a dodržování právních předpisů a laboratoř EURL-FV hraje klíčovou roli při zajišťování bezpečnosti spotřebitelů tím, že zlepšuje kvalitu, přesnost a srovnatelnost výsledků testů bezpečnosti potravin.

Nejčastěji používanou metodou při analýze reziduí pesticidů je kapalinová chromatografie s reverzní fází v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Důvodem je její robustnost a široká použitelnost pro semipolární a některé termolabilní pesticidy. Nicméně superkritická fluidní chromatografie (SFC) - široce používaná v oblastech, jako je farmaceutický sektor - se příležitostně používá i při analýze reziduí pesticidů, a to díky svým výhodám, např. v oblasti ionizace.

Použitá konfigurace

• Jediný kombinovaný chromatografický systém: Nexera UC
• Čerpadlo CO₂
• Regulátor protitlaku
• Hmotnostní spektrometr s trojitým kvadrupólem: LCMS-8060
• Iontový zdroj: ESI

Shimadzu: Víctor Cutillas (European Union Reference Laboratory for Pesticide Residues in Fruit & Vegetables, University of Almería)

Jednoho dne se Víctor a tým EURL-FV velmi intenzivně věnovali analýzám, při nichž používali jak metody LC-MS/MS, tak SFC-MS/MS. Jak prováděli další a další vzorky, začali si všímat, že termolabilní sloučeniny, které obvykle v iontovém zdroji trpí, vykazují při použití SFC pozoruhodnou stabilitu. Kromě toho některé chemické skupiny vykazovaly při použití SFC mnohem lepší citlivost, než jakou kdy zaznamenali při použití LC. A přestože očekávali určité snížení matricových efektů při použití SFC, výsledky často předčily jejich očekávání - někdy dramaticky.

Srovnání výkonnosti LC a SFC pro analýzu více složek pesticidů v potravinách

Cutillas se rozhodl provést formální studii obou metod, protože ho zajímalo, zda byl potenciální přínos SFC pro jejich práci podceněn. Cílem studie bylo přímo porovnat výkonnost LC a SFC u 215 pesticidů v ovoci a zelenině za použití stejného hmotnostního spektrometru (Nexera UC spojený s LCMS-8060, oba od společnosti Shimadzu). Zaměřila se na citlivost, matricové efekty a účinnost ionizace u různých vzorků potravin, včetně rajčat, póru, cibule a pomeranče.

Shimadzu: Obrázek 1 - Procento identifikovaných sloučenin při třech testovaných teplotách iontového zdroje. 215 pesticidů bylo hodnoceno pomocí LC i SFC v rozpouštědle a v matricích rajčat, cibule, póru a pomeranče.

Citlivost a teplota iontového zdroje

Studie hodnotila optimální teploty rozhraní elektrosprejové ionizace (ESI) pro obě techniky, což je rozhodující pro dosažení nejvyšší citlivosti při detekci pesticidů. Tyto informace jsou shrnuty na obrázku 1. LC vykazovala mírně vyšší citlivost při teplotě 350 °C, přičemž při této teplotě bylo identifikováno 95 % pesticidů v čistém rozpouštědle a 92 % v matrici rajčat. Oproti tomu SFC vykazovala konzistentní výsledky v širším teplotním rozsahu, přičemž 99 % pesticidů bylo stanoveno v čistém rozpouštědle a 95 % v matrici rajčat i při nižších teplotách, jako je 200 °C a 125 °C.

Ve složitých matricích, jako je pórek a cibule, byly rozdíly výraznější. V případě pórku LC identifikovala 80 % pesticidů při 350 °C, ale pouze 69 % při 125 °C. SFC si však zachovala vyšší míru identifikace 83-85 % při všech teplotách. Podobně u cibule LC určila 89 % pesticidů při 350 °C, ale při 125 °C klesla na 67 %, zatímco SFC identifikovala trvale 86-89 %. To naznačuje, že SFC může být univerzálnější při práci s různými teplotami iontových zdrojů, aniž by byla ohrožena citlivost, což nabízí významné výhody pro laboratoře, které se zabývají různými vzorky potravin.

Shimadzu: Tabulka 1 - Procento 215 pesticidů ovlivněných účinky matrice v matricích rajčat, póru a pomeranče při použití LC na reverzní fázi a SFC

Citlivost chemické skupiny

Různé chemické skupiny reagovaly na každou chromatografickou techniku jedinečně. Například mezi 70 sloučeninami vykazujícími vyšší citlivost při LC bylo 27 % organofosfátů. Karbamáty, deriváty močoviny a triaziny rovněž vykazovaly vysokou citlivost při LC, přičemž 10, 7 a 6 pesticidů vykazovalo o více než 50 % vyšší hodnoty plochy než SFC.

Naopak mezi 77 sloučeninami vykazujícími vyšší citlivost při SFC bylo 22 % triazolů, jako je bromukonazol a cyprokonazol. Ostatní skupiny, jako jsou benzoylurey a neonikotinoidy, měly rovněž lepší výsledky v SFC. K této zvýšené citlivosti pravděpodobně přispěla nepolární povaha superkritického CO₂ používaného při SFC spolu s jeho jedinečným mechanismem eluce. Průměrné hodnoty logP_ow byly u obou technik podobné, což naznačuje, že samotná polarita neurčuje nejlepší techniku pro jednotlivé pesticidy. Tato nuance pomáhá laboratořím vybrat nejvhodnější techniku na základě chemické povahy analytů, s nimiž se setkávají.

Vliv matrice a potlačení iontů

Účinky matrice mohou významně ovlivnit přesnost a spolehlivost analýzy reziduí pesticidů. Studie odhalila, že SFC má nižší stupeň potlačení iontů než LC, zejména ve složitých matricích, jako je pór, cibule a pomeranč. Například v póru mělo pouze 5 % pesticidů v LC nízké nebo žádné matricové efekty (0-20 %), zatímco 28 % pesticidů v SFC spadalo do této kategorie. U cibule byly výsledky podobné, 11 % pesticidů analyzovaných LC vykazovalo nízké matricové účinky ve srovnání s 29 % u SFC.

U pomerančové matrice byl rozdíl ještě markantnější. Pouze 7 % pesticidů analyzovaných pomocí LC mělo nízké matricové účinky ve srovnání s 53 % u SFC. Tato zjištění mají zásadní význam, protože ukazují, že SFC je účinnější při snižování potlačení iontů způsobeného koextrahovanými složkami matrice. To lze přičíst účinnosti rozprašování a odběru vzorků při SFC, která minimalizuje koeluci se složkami matrice. Kromě toho hrají zásadní roli rozdílné eluční profily SFC a LC, přičemž jedinečný mechanismus SFC snižuje překrývání mezi analyty a interferujícími látkami, čímž zvyšuje citlivost a přesnost identifikace (obrázek 2).

Cutillasova srovnávací studie odhalila, že ačkoli LC i SFC mají své přednosti, SFC nabízí výrazné výhody při analýze složitých potravinových matric s vysokým obsahem koextraktů. Její schopnost zachovat citlivost při nižších teplotách iontového zdroje ji činí obzvláště vhodnou pro termolabilní sloučeniny. Rutinní laboratoře mohou mít prospěch ze začlenění SFC do svých pracovních postupů pro lepší analýzu reziduí pesticidů. Při volbě mezi LC a SFC je třeba zvážit konkrétní potřeby laboratoře, včetně typů analyzovaných pesticidů a složitosti příslušných potravinových matric. Díky své konzistentní vysoké citlivosti při různých teplotách a nižšímu vlivu matrice představuje SFC robustní a univerzální alternativu pro moderní analýzu reziduí pesticidů.

Shimadzu: Obrázek 2 - Chromatogramy celkových iontů (TIC) oranžové matrice se překrývají s chromatogramy multireziduálních metod na úrovni koncentrace 5 μg/kg

Cutillas také poznamenává, že SFC je udržitelnější metoda analýzy, protože produkuje méně odpadu. CO₂, který používá, je recyklovatelný, zatímco LC je závislá na větším množství organických rozpouštědel. Navíc díky použití zařízení, jako je Nexera UC, mohou laboratoře provozovat obě metody na stejné platformě bez dalšího hardwaru.

Znalosti jsou složitý konstrukt a někdy to, co si myslíme, že „víme“, je pouze maskou naší nevědomosti. V tomto případě se to, co bylo považováno za zálohu, změnilo v průlom. Skutečné znalosti tu celou dobu ležely a čekaly, až si jich všimne zvědavý vědec. A nyní se díky Víctoru Cutillasovi a týmu z EURL-FV ve Španělsku objevil účinnější, citlivější a udržitelnější způsob zajištění bezpečnosti potravin. Výsledkem je pokrok: pro laboratoře, pro vědu i pro lidstvo.