Využití superkritické fluidní chromatografie pro stanovení pesticidů v ovoci a zelenině (SFC-MS/MS)

Před lidstvem v příštích letech stojí několik velkých výzev. Jednou z nich je zajištění potravy pro rostoucí světovou populaci, která má v roce 2050 dosáhnout neuvěřitelných 9,7 miliardy lidí. Celou situaci sleduje Organizace pro výživu a zemědělství (FAO – Food and Agriculture Organization). Ta upozorňuje, že kromě potřeby rostoucích zemědělských ploch (neboli zvýšení produkce) bude potřeba také neustále kontrolovat používané pesticidy, které sice ochraňují plodiny před možnými škůdci, ale mohou mít negativní účinky pro člověka. Možná rizika pesticidů pro člověka aktuálně posuzuje Světová zdravotní organizace (WHO) ve spojení s FAO. I malé množství může u člověka vyvolat nepříznivý účinek, a proto jsou limity detekce pesticidů nastaveny velmi nízko. To klade důraz na laboratoře životního prostředí, které musí pesticidy analyzovat pomocí vysokocitlivostní analýzy.

Jako běžný pomocník laboratoří životního prostředí již stabilně slouží kapalinový chromatograf ve spojení s hmotnostním spektrometrem typu trojitý kvadrupól (LC-MS/MS). Vysokocitlivostní analýza pomocí tohoto přístroje je již velmi dobře zavedená a používaná po celém světě. Shimadzu si dlouho zahrávalo s myšlenkou vyvinout analytickou metodu stanovení pesticidů pomocí superkritické fluidní chromatografie (SFC) ve spojení hmotnostním spektrometrem. Příležitost se naskytla ve chvíli, kdy evropská legislativa zpřisnila a snížila limity detekce některých pesticidů. V tu chvíli Shimadzu přišlo s velmi zajímavou alternativou oproti klasickému LC-MS/MS. SFC je označována jako zelená technologie. Při provozu takového přístroje je totiž minimalizována spotřeba rozpouštědel – oproti tradičnímu LC-MS/MS vzniká minimum odpadu. Jako hlavní mobilní fáze se zde využívá oxid uhličitý o přesném tlaku a teplotě. Taková mobilní fáze má pak velmi zajímavé schopnosti separace. A právě toho specialisté v Shimadzu využili pro vývoj nové metody multireziduálního stanovení pesticidů.

Konfigurace přístroje

SFC-MS/MS systém, nazývaný Nexera UC (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonsko), byl konfigurován ze:

• 2 binárních čerpadel
• CO₂ čerpadla
• autosampleru
• kolonového termostatu
• regulátoru protitlaku (BPR) zapojeným hned před hmotnostní detektorem.

BPR zde umožňuje transfér celkového eluátu z kolony do hmotnostního detektoru bez možného rozmytí zóny analytu (difuze). V tomto zapojení byl použit „High-End“ model hmotnostního detektoru typu trojitý kvadrupól, typ LCMS-8060.

Shimadzu: Nexera UC SFC system

SFC Chromatografie: Shimadzu Nexera UC SFC system

• Analytická kolona: Shim-pack UC-X RP (3 μm, 100 × 2,1 mm)
• Teplota kolony: 50 °C
• Průtok: 1,5 mL/min
• Čerpadlo A: CO₂
• Čerpadlo B: Metanol, 5 mmol/L octanu amonného
• Čerpadlo C: Metanol, 5 mmol/L octanu amonného a 0,1% kyseliny mravenčí
• Binární gradient: B 2% (0,0 - 2,0 min) - 24% (7,0 min) - 40% (7,5 - 9,5 min) - 2% (10,00 min) - Stop (13,5 min)
• Objem nástřiku: 2 μL

SFC-MS/MS hmotnostní spektrometrie: Shimadzu LCMS-8060

• Teplota interface: 300 °C
• Teplota vyhřívaného bloku: 400 °C
• Teplota desolvační linie: 250 °C
• Nebulizační plyn: 3,0 L/min
• Výhřevný plyn: 10 L/min
• Sušicí plyn: 10 L/min
• Doba pauzy/setrvání: 1 msec
• Ionizační mód: Přepínání polarity
• Doba přepínání polarity: 5 msec
• Napětí na interface: 4 kV

Shimadzu: Konfigurace zapojení SFC-MS/MS

Příprava vzorku

Pro analýzu byly použity ekologické plodiny zakoupené na místním trhu v Almerii (Španělsko). Není žádným překvapením, že právě tato oblast je jedním z největších producentů ovoce a zeleniny na celém světě. Potravinářské produkty byly vybrány tak, aby odrážely řadu analytických problémů: rajče je matrice s vysokým obsahem vody, pomeranč je vysoce kyselý a pórek představuje matrici s vysokým počtem endogenních složek. Všechny potravinářské produkty byly extrahovány podle metody QuEChERS 1. Tyto extrakty byly poté spikovány 164 standardy pesticidů, které jsou všechny uvedeny v Monitorovacím programu Evropské unie. Pro identifikaci sloučeniny zahrnoval kalibrační rozsah standardy při 0.005, 0.01, 0.02, 0.05 a 0.1 mg/kg.

Vývoj metody

Superkritický oxid uhličitý má velmi nízkou viskozitu a vysokou difuzivitu zajišťující rychlý přesun hmoty a vysoké průtoky. V této práci byl použit průtok 1,5 ml/min, což zajistilo dobu analýzy pouhých 7,5 minuty pro stanovení 164 pesticidů. Vysoký průtok CO₂ zkrátil dobu analytického cyklu, ovšem iontová odezva a tvar píku několika cílových sloučenin byly méně než optimální. Pro zvýšení tvaru píku a iontové odezvy byla do konfigurace přístroje přidána „make up“ pumpa s methanolem obsahujícím 5 mmol/L roztok octanu amonného a 0,1% kyseliny mravenčí. Toto řešení zajistilo výrazné zvýšení citlivosti pro všechny cílové sloučeniny. Ve srovnání s konvenčními LC-MS/MS metodami, SFC-MS/MS zajišťoval nižší potlačení iontového signálu.

SFC-MS/MS analýza

Výsledná zoptimalizovaná metoda pro stanovení pesticidů generuje více cyklů analýz při zajištění vyšších průtoků a dvojnásobně vyšší citlivosti měření ve srovnání s LC-MS/MS metodou.

Shimadzu: Optimalizovaná metoda stanovení 164 pesticidů v analýze trvající 7,5 minuty

Shimadzu: Porovnání retenčních časů stejných analytů při SFC-MS/MS a LC-MS/MS analýze.jpg

Závěr

SFC-MS/MS byl vyhodnocen jako součást rutinního programu monitorování pesticidů díky porovnání s konvenční platformou LC-MS/MS s reverzní fází. Klíčové výhody SFC-MS/MS se týkají rychlejších analytických časů, snížených matricových efektů a zýšené citlivosti, protože Nexera UC využívá tzv. „splitless“ přenos eluentu do hmotnostního spektrometru. Výsledkem toho je metoda, která odhalí 164 pesticidů při daných limitech stanovených Evropskou unií. V rutinní kvantitativní analýze je metoda reprodukovatelná a typicky vede k lineárním kalibračním křivkám (R² větší než 0,996).

Shimadzu: Ukázka vybraných analytů u kterých bylo s použitím SFC-MS/MS dosaženo lepší citlivosti (100 μg/kg rajčata)

V případě většího zájmu o Shimadzu řešení analýzy životního prostředí nebo více informacích o superkritické fluidní chromatografii neváhejte kontaktovat obchodního zástupce Shimadzu: Mgr. Ondřej Hillmich ([email protected]).

Přehled nejnovějších SFC aplikací

• ASMS 2021: An evaluation of rapid method for simultaneous analysis of ciclesonide and its impurities in an inhaler using online SFE-SFC-QTOFMS | 2021 | Postery

• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph | 2021 | Příručky

• Optimization of Analytical Conditions, and Scale-up from Analytical to Preparative Scale Using Supercritical Fluid Chromatography | 2019 | Technické články

• Evaluating the Performance of the LotusStream Gas-Liquid Separator for Preparative Supercritical Fluid Chromatography | 2020 | Technické články

• Application of SFC-MS/MS for the Quantification of Highly Polar Pesticides in a Range of Food Samples | 2019 | Postery

• Development and Validation of on-line SFE-SFC-MS/MS Method for Screening of Aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in Grain Matrices | 2019 | Aplikace

• Separation of Lipids Using the Nexera™ UC Supercritical Fluid Chromatograph | 2019 | Aplikace

• Quantitative Analysis of Glucosylceramide in Commercial Supplement | 2021 | Aplikace

• Determination of Pesticides in Dog Collars by On-line Supercritical Fluid Extraction/Chromatography Mass Spectrometry | 2019 | Postery

• Analysis of 9 Cannabinoids by Supercritical Fluid Chromatography | 2020 | Postery

• Analysis of Fat-soluble Vitamins Using the Nexera™ UC Supercritical Fluid Chromatograph | 2019 | Aplikace

• Improved Efficiency of Isomer Preparative Operations by Supercritical Fluid Chromatography with Stacked Injection | 2019 | Technické články

• Determination of pyrrolizidine alkaloids in plant material using SFC-MS/MS | 2019 | Postery

• Analysis of Triglycerides Using the Nexera™ UC Supercritical Fluid Chromatograph | 2019 | Aplikace