Organická analýza - kapalinová chromatografie (LC) 4/4 (TLC)

5.10 Kapalinová chromatografie v plošném uspořádání: Chromatografie na papíru a na tenkých vrstvách

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Kapalinová chromatografie v plošném uspořádání: Chromatografie na papíru a na tenkých vrstvách

Planární chromatografie je v klasickém provedení instrumentálně nenáročná a rozvíjela se již ve čtyřicátých a padesátých letech minulého století. Lože se stacionární fází zaujímá tenkou obdélníkovou vrstvu, která je u papírové chromatografie (PC) vymezená tloušťkou chromatografického papíru. Chromatografický papír (Schleicher-Schűll) tvoří téměř čistá celulózová vlákna (0,16 - 0,50 mm), bez pojiv. Je označen číslem podle hustoty (gramáže). Čím větší je hustota a tloušťka vrstvy, tím pomaleji papír „teče“ a separace trvá déle, ale zlepšuje se rozdělení látek a zvyšuje se možnost zatížení papírové vrstvy vzorkem. Dávkování vzorků na papír, vyvíjení a detekce separovaných skvrn látek se v podstatě řídí stejnými pravidly jako chromatografie na tenkých vrstvách adsorbentu.

Planární chromatografie se provádí v off-line režimu, což znamená, že základní kroky procesu (nanášení vzorku, vyvinutí desky, derivatizace, detekce, vyhodnocení) jsou nezávislé na sobě, čase a místě. Z toho vyplývají některé specifické výhody a velká flexibilita při výběru stacionárních a mobilních fází.

Obecné výhody metody jsou:

• paralelní analýza a vizuální porovnání více vzorků a standardů;

• jednorázové použití stacionární fáze snižuje potřebu čištění vzorků;

• možnost vícenásobné detekce bez nutnosti opakování procesu;

• pohodlná chemická derivatizace separovaných látek;

• detekce biologické aktivity;

• nízké náklady a rychlost.

U klasické tenkovrstvé chromatografie (thin-layer chromatography, TLC) se pravidelná tenká vrstva 0,1 - 0,25 mm adsorbentu s relativně širokou disperzí částic pod 20 μm, nemodifikovaného silikagelu či silikagelu s chemicky navázanými alkylovými, aminovými, kyanovými a diolovými fázemi, jako u sloupcové kapalinové chromatografie. Stále se poměrně často používají i jiné adsorbenty: oxid hlinitý, polyamid, či celulózový prášek zpevněný škrobem, sádrou nebo arboxymethylcelulózou jako pojivem. K adsorbentu se někdy přidává fluorescenční indikátor pro usnadnění vizuální detekce – pod UV lampou se skvrny látek projeví zhášením fluorescence. Tenká vrstva adsorbentu je fixována na podložní hliníkové či skleněné destičce. Původně se vrstva adsorbentu nanášela ručně, v současné době se používají výhradně hotové chromatografické desky s prefixovanou vrstvou sorbentu, většinou o rozměrech 20x20, 20x10, a 10x5 cm.

2 Theta: Chromatografie v plošném uspořádání (na papíru nebo tenké vrstvě)

Na papíru nebo na destičce s tenkou vrstvou adsorbentu se nejprve označí místa na startovní linii, kam se nanese malý objem roztoku vzorku (1-5 μl). Ruční nanášení vzorků na start z injekční mikrostříkačky je v moderní technice TLC nahrazeno posuvným modulem s aplikační hlavou, v níž jsou upevněny skleněné dávkovací kapiláry.

Po odpaření rozpouštědla se papír či destička s natečkovanými vzorky umístí do uzavřené vertikální nebo horizontální chromatografické komory, kde se na ni zavádí směs rozpouštědel, která slouží jako vyvíjecí soustava (mobilní fáze), jejímiž parami je komora předem nasycena.

Na rozdíl od HPLC, kde se před dávkováním vzorku kolona vyrovná s mobilní fází, v klasické TLC se vzorky dávkují na suchou vrstvu a vyvíjení chromatogramu probíhá působením kapilárních sil v pórech vrstvy, buď v sestupném, nebo vzestupném uspořádání.

Skvrny vzorku mají kruhový tvar, někdy poněkud deformovaný protažením ve směru pohybu vyvíjecí soustavy – chvostování - a zaujmou různé polohy mezi startem a čelem na plošném chromatogramu a zviditelní se buď v ultrafialovém světle, nebo po barevné reakci, vyvolané postřikem vhodným detekčním činidlem. Poloha středu skvrny je charakteristická pro identitu látky, podobně jako eluční čas ve sloupcové chromatografii a vyhodnocuje se jako retardační faktor,

Shrnutí

Proti HPLC má TLC nevýhodu v hůře definovaném systému, nižší účinnosti separace, citlivosti a přesnosti stanovení. Výhodou je naopak analýza složitých matric vzorků (sacharidy, lipidy) bez předchozích zdlouhavých úprav a široká škála vzorků, které lze pomocí TLC/HPTLC určit. Dále možnost současné analýzy většího množství vzorků a opakovaného vyvíjení. Obzvláště v moderní TLC/HPTLC je velkou výhodou časová nenáročnost (díky stanovení několika vzorků najednou) a ekonomická úspora, protože oproti HPLC stačí malé množství rozpouštědel a není vždy nutné mít vysokou čistotu těchto rozpouštědel, jako je tomu u HPLC. Také robustnost metody je velikou výhodou. Nejen proto se TLC stále často využívá pro rychlý screening velkého počtu vzorků před případnou přesnější HPLC analýzou. Konečně v plošném uspořádání lze relativně snadno realizovat dvourozměrné separace. Po ukončení dělení v jednom směru se deska vysuší, otočí o 90° a částečně separovaný vzorek se podrobí separaci v jiné vyvíjecí soustavě v kolmém směru na původní směr vyvíjení, takže výsledkem je lepší pokrytí plochy tenké vrstvy a využití dostupného separačního prostoru pro složitý vzorek [2].