Přihlášení
Registrace
Nastavení
Filtrování
Filtrování
Obnova hesla
Obnova hesla
Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech
St, 30.9.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.

Pixabay/skeeze: Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech

Článek popisuje způsoby analytického stanovení polyfenolů v pivovarství. Metody pro toto stanovení jsou rozděleny do dvou skupin, analytické metody pro stanovení skupin polyfenolů a metody pro stanovení individuálních polyfenolů. Skupinové metody slouží ke stanovení anthokyanogenů, tanoidů a flavonoidů. Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.

1 ÚVOD

Polyfenoly jsou sekundární metabolity rostlin, které do piva přechází ze sladu a chmele. V průběhu pivovarského procesu dochází ke změnám jejich zastoupení a struktury a v řadě kroků ovlivňují technologický postup.

Mezi jejich nejdůležitější chemické vlastnosti patří schopnost reagovat s proteiny za tvorby výšemolekulárních komplexů a dále jejich antioxidační aktivita. Tvorba polyfenolbílkovinných komplexů negativně ovlivňuje koloidní stabilitu piva, zatímco redukční schopnost a schopnost vychytávání volných radikálů působí pozitivně na senzorickou stabilitu piva i na lidské zdraví.

Polyfenoly jakožto přirozené antioxidanty vyskytující se v potravě mohou snižovat pravděpodobnost výskytu některých civilizačních chorob konzumentů, v této souvislosti se uplatňují především antiaterosklerotické, antikarcinogenní, případně fytoestrogenní účinky některých polyfenolových látek.

Z uvedených důvodů jsou analytické metody stanovení polyfenolů předmětem výzkumu nejen pivovarských analytiků. Ačkoliv v minulosti se používala celá řada různorodých způsobů stanovení těchto látek, dnes analýze dominuje především vysokoúčinná kapalinová chromatografie se spektrofotometrickou, hmotnostní nebo elektrochemickou detekcí. Aktuálním problémem stanovení je izolace, přečištění a zakoncentrování analyzovaných látek z vysoce komplexní přírodní matrice.

2 ANALYTICKÉ METODY PRO STANOVENÍ POLYFENOLŮ

Metody používané v analýze polyfenolových látek je možno v současné době rozdělit do dvou hlavních částí. První z nich využívá společných vlastností větších či menších skupin polyfenolových sloučenin a jedná se tedy o metody skupinové.

Analytickým metodám pro stanovení jednotlivých polyfenolových látek dominuje HPLC (High Performance Liquid Chromatography – vysokoúčinná kapalinová chromatografie) na reverzní fázi s různými možnostmi detekce UV-VIS, DAD (detektor s diodovým polem), MS (hmotnostní detektor). Staršími možnostmi jsou kapilární plynová chromatografie (CGC), papírová chromatografie (PC), chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a podobně (1).

2.1 Skupinové analytické metody
Stanovení celkových polyfenolů metodou EBC:

Tato metoda je založena na reakci polyfenolů s trojmocnými ionty železa v alkalickém prostředí, při které dochází k tvorbě červeně zbarveného komplexu. Intenzita vzniklého zbarvení je měřena spektrofotometricky při vlnové délce λ = 600 nm proti slepému pokusu. Výsledek je dán vzorcem a uvádí se v miligramech na litr (2).

Stanovení anthokyanogenů podle Harrise a Ricketse:

V této metodě jsou polyfenolové látky vzorku nejprve adsorbovány polyamidovým práškem, zachycené látky jsou potom z adsorbentu uvolněny za tepla působením směsi butanol-chlorovodíkové kyseliny. Intenzita zbarvení vzniklých oxoniových solí je určena spektrofotometricky při λ = 550 nm proti slepému pokusu. Závislost obsahu anthokyanogenů na naměřené absorbanci je tabelována a výsledky je možno odečíst z tabulky (3).

Stanovení tanoidů podle Chapona:

Metoda je založena na principu tvorby komplexů polyfenolů s polyvinylpyrrolidonem (PVP).Do roztoku obsahujícího tanoidy se dávkuje polyvinylpyrrolidon (PVP). Vzniká zákal, jehož intenzita se zvyšuje tak dlouho, než se všechny tanoidy adsorbují. Množství PVP, které se musí přidat k dosažení maxima zákalu, je proporcionální obsahu tanoidů. Vzniklý zákal se změří nefelometricky. Výsledek je dán vzorcem a je vyjádřen v miligramech PVP na litr (3).

Stanovení flavanoidů:

V kyselém prostředí reagují flavanoidy s chromogenem pdimethylaminocinnamaldehydem za vzniku barevných pigmentů. Metoda dovoluje kvantitativní stanovení např. katechinu a proanthokyanidinu. Vzorek se smíchá s kyselou solucí chromogenu a výsledná intenzita zbarvení je proměřena spektrofotometricky při vlnové délce λ = 640 nm. Výsledek je dán vzorcem a je vyjádřen v katechinových ekvivalentech v miligramech na litr (2).

2.2 Analytické metody pro stanovení jednotlivých polyfenolů

Volby jednotlivých analytických kroků pro stanovení jednotlivých polyfenolů jsou shrnuty v následující části. Extrakce a zakoncentrování stanovovaných látek bývá běžně provedeno v jednom kroku, dále se někdy zavádí frakcionace polyfenolů na fenolové kyseliny a neutrální látky.

2.2.1 Extrakce, zakoncentrování a purifikace

Nízká hladina polyfenolových látek v analyzovaném materiálu často vyžaduje provedení vhodné extrakce vedoucí k získání zakoncentrovaného podílu analyzovaných látek s redukovaným obsahem interferujících příměsí. Vzhledem ke značné složitosti chromatogramů extraktů polyfenolů z HPLC, zavádí někteří autoři analytické kroky vedoucí k frakcionaci polyfenolových látek nejčastěji na základě rozdílné disociační konstanty (4,5).

Z hlediska provedení se dají jednotlivé metody extrakce rozdělit do dvou následujících skupin: LLE (Liquid-liquid extraction – extrakce kapalina-kapalina) a SPE (Solid Phase Extraction – extrakce na pevné fázi). Např. Bendini a kol. 6 se zabývali porovnáním výtěžností extrahovaných látek z olivového oleje pomocí SPE a LLE. Pirisi a kol. (7) se také zabývají srovnáním SPE s C18 a C8 náplní a LLE s hexanem. Kvantifikace zachycených sloučenin byla provedena pomocí HPLC-DAD-MS a CZE (kapilární zónová elektroforéza) s UV-VIS detekcí. Pořadí jednotlivých metod dle klesající výtěžnosti bylo LLE, C18 a C8-SPE.

Extrakční a čisticí kroky obecně prodlužují dobu analýzy, Cappanesi a kol. 8 uvádí alternativní možnost detekce pomocí biosenzoru, založené na tyrosinasové oxidaci polyfenolových sloučenin, která nevyžaduje předcházející úpravu vzorku.

2.2.1.1 Kapalinová extrakce – (LLE – Liquid-liquid extraction)

V potravinářské analýze polyfenolových látek existuje velká variabilita různých analyzovaných materiálů, přesto se pro účely kapalinové extrakce používá relativně malé množství extrakčních činidel, a to buď samotných, nebo ve vzájemné kombinaci.

Tradičními běžně používanými rozpouštědly jsou horká voda, methanol, ethanol, aceton, a ethylacetát, který se vyskytuje nejčastěji. Vzácněji jsou používána jiná rozpouštědla, např. acetonitril, DMF (dimethylformamid) a chloroform (5, 9).

Extrakce je z důvodu dosažení maximálního výtěžku často prováděna za nepřístupu světla, kyslíku, s přídavkem umělých antioxidantů apod. Mechanická úprava vzorku bývá použita k zamezení molekulárních interakcí, respektive k podpoře uvolnění látek z vázaných forem. Nejčastějším provedením extrakce fenolových kyselin bývá opakovaná Soxhlethova extrakce trvající v jednom kroku jednu až šest hodin (1).

Extrakce flavonoidů a jednoduchých fenolových kyselin probíhá obdobně, rozdělovacím faktorem je pH, čehož lze využít pro oddělení těchto dvou frakcí. Frakcionaci je tedy možné provést např. kapalinovou extrakcí ethylacetátem při pH 7 a při pH 2, případně zádrží na C18 koloně a elucí roztoky o různém pH. Jinou možností rozdělení polyfenolů na fenolové kyseliny a neutrální látky může být frakcionace pomocí iontovýměnné chromatografie na silném anexu (1, 10).

Z jiných možností např. Chang a kol. (11) uvádí možnost použití nadkritické fluidní extrakce oxidem uhličitým pro izolaci polyfenolových látek zeleného čaje.

2.2.1.2 Extrakce na pevné fázi – (SPE)

K tomuto druhu extrakce se nejčastěji používá chromatografických náplňových kolon s řadou adsorpčních materiálů, jako jsou polyamidové materiály, PVPP, Sephadex, modifikovaný silikagel, mikrokrystalická celulosa a další. S extrakčním krokem analýzy zde bývá často spojeno i přečištění analytu, případně frakcionace jednotlivých skupin polyfenolových látek. Silikagel je zvláště vhodný pro analýzu méně polárních isoflavonů, flavanonů, flavonů a flavonolových glykosidů. K modifikaci vnitřního povrchu silikagelové náplně kolon se používají obdobné funkční skupiny jako v případě kolon pro HPLC na reverzní fázi (C8, C18, DIOL). Naproti tomu polyamid je adsorbent vhodný pro separaci flavonoidů o různé polaritě, zvláště pak glykosidů (12). Minikolonky s náplní polyamidu 6 byly použity k frakcionaci flavonolů z červené malinové šťávy. První část flavonoidů, která byla získaná elucí methanolem, obsahovala glykosidy kvercetinu, kvercetin a kempferol. Druhá část byla z kolony vymyta mobilní fází skládající se z 0,5% roztoku amoniaku v methanolu a obsahovala flavonolové glukuronidy, aglykony, kyselinu ellagovou a její deriváty (13).

Např. Mc Murrough a kol. (14) uvádějí extrakci směsí aceton/voda, odpaření rozpouštědla, rozpuštění zbytku v ethanolu a následnou frakcionaci polyfenolů na koloně s náplní Sephadex.

García a kol. (5) uvádí metodu zakoncentrování na C18 Sep-Pak koloně kondicionované methanolem a promyté vodou. Po nanesení a eluci okyseleného vzorku byla kolona vysušena dusíkem. Zachycené fenolové látky byly eluovány acetonitrilem a po odpaření rozpouštědla na vakuové odparce opět rozpuštěny ve směsi methanol/voda (1:1) s 1 % kyseliny sírové. Oddělení flavanových glykosidů od flavonolů nebo flavonových glykosidů je obvykle obtížné, ale může být provedeno na celulosových kolonách s vodou jako promývacím roztokem (15).

2.2.2 Chromatografické metody a detekce látek

Mezi starší metody analýzy polyfenolů v potravinách patří jednoduchá provedení chromatografických metod. Do této skupiny patří např. papírová chromatografie (PC), používající jako stacionární fázi chromatografický papír.

Z dalších dříve značně využívaných metod je možno zmínit např. chromatografii na tenké vrstvě (TLC) s různými možnostmi stacionární fáze (silikagel, celulosa, polyamid). Výběr pevné fáze závisí na skupině flavonoidů, která má býti analyzována, hydrofilní flavonoidy mohou být snadno separovány pomocí TLC na polyamidu nebo mikrokrystalické celulose. Silikagel bývá používán při TLC analýze méně hydrofilních látek jako jsou flavony a isoflavony. Detekce separovaných skupin analytů je prováděna reakcí s činidly za tvorby barevných komplexů, případně tvorby fluoreskujících komplexů. Chromatografie na tenké vrstvě je finančně a časově nenáročná, její hlavní nevýhodou je omezená možnost kvantifikace a nízká výtěžnost (1, 13, 17).

2.2.2.1 Kapilární zónová elektroforéza – (CZE)

CZE je vysoce účinná metoda, při které dochází k separaci látek na krátké křemenné kapiláře s průměrem od 50–100 μm. Jedná se o poměrně rychlou a levnou metodu, která může dosáhnout lepší selektivity než analýza pomocí HPLC (9). Separaci kromě parametrů kapiláry ovlivňuje navíc pH a také organické látky, které se používají jako modifikátory v nosných elektrolytech. Tato rozpouštědla ovlivňují pohyblivost analytu snížením polarity pufru, mohou zlepšit selektivitu a tím zvýšit pravděpodobnost identifikace analyzovaných látek (18). CZE umožňuje paralelní stanovení široké škály nabitých látek, zatímco sloučeniny bez náboje jsou odnášeny elektroosmotickým tokem bez separace. Molekuly flavonoidů obsahují elektrický náboj v alkalickém prostředí. Aby nedošlo k zahlcení kapiláry, bývá objem analyzovaného vzorku velmi nízký (13).

Na rozhraní mezi elektroforetickými a chromatografickými metodami se pohybuje micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC).

2.2.2.2 Plynová chromatografie – (GC)

Základním problémem použití této analytické metody je nízká těkavost fenolových sloučenin. Z tohoto důvodu se její využití omezuje především na stanovení jednoduchých fenolových kyselin a nízkomolekulárních flavonoidů. Hydroxylové skupiny je nutno převést na ethery, případně estery. K derivatizaci bývá nejčastěji použita trialkylsilylová skupina, nejčastěji v podobě trimethylsilylových derivátů. Nejběžněji používanými silylačními činidly pro derivatizaci fenolových kyselin jsou N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamid, N-metyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid a N,O-bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid. Pro vlastní chromatografické rozdělení jsou nejčastěji použity kapilární kolony z taveného křemene o délce 25–30 m, vnitřním průměru 0,25–0,5 mm a tloušťce vnitřní vrstvy (stacionární fáze) 0,25 μm. Jako příklad používané stacionární fáze je možno uvést polysiloxanový materiál DB-5, který obsahuje 95 % methylových a 5% fenylových substituentů.

K detekci byl dříve běžně používán plamenově ionizační detektor (FID), dnes převládá spojení plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) v uspořádání s ionizací nárazem elektronu (EI) (1, 19).

2.2.2.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – (HPLC)

Nejpoužívanější současnou metodou pro stanovení polyfenolových látek je vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi.

Kolony používané v HPLC analýze bývají 10–100 cm dlouhé (nejčastěji 10–25 cm), jejich vnitřní průměr se obvykle pohybuje v rozmezí od 0,2 do 5 mm. U přírodních vzorků obsahujících větší množství balastních látek, které by mohly vyvolat předčasné znehodnocení kolony, bývá často před vlastní kolonou zařazena ochranná předkolonka. Jako chemicky vázané stacionární nepolární skupiny pro reverzní fázi se nejčastěji používají C8H17–, C18H37– a méně často fenyl. Tyto skupiny jsou obvykle vázány na vrstvu silikagelu. Pro takto hydrofobizovanou stacionární fázi se používá spíše polárních mobilních fází na bázi binárních až ternárních směsí vody, methanolu, acetonitrilu, THF (tetrahydrofuran) či dioxanu. Retenční poměry řady látek se dají ovlivnit změnou pH mobilní fáze (např. zvýšením pH mobilní fáze se zvyšují retenční časy bazických látek a snižují retenční časy kyselých složek) (16, 20).

V analýze fenolových látek je téměř výhradně používána stacionární fáze C18 s vnitřním průměrem kolony od 2 do 5 mm (HPLC ve spojení s hmotnostní detekcí využívá menších průměrů). Velikost částic bývá většinou 3 až 5 μm. Nejčastěji se používá lineární gradientová eluce, mobilní fáze se skládá z polární a nepolární části, někdy obsahuje i roztoky s pufrační kapacitou. Vodná fáze obsahuje často přídavek kyseliny octové, používaná organická rozpouštědla v nepolární fázi jsou methanol, acetonitril, propanol, butanol, THF, ethylacetát a další. Volba mobilní fáze a její pH závisí na druhu použité stacionární fáze. Mobilní fáze obsahují často příměsi organických kyselin (nejčastěji kyselina octová) pro zvýšení retence slabě kyselých látek, případně příměsi slabých zásad pro zvýšení retence slabě zásaditých látek. Eluce bývá obvykle prováděna s binárním lineárním gradientem (1, 21).

HPLC s reverzní stacionární fází je používána především pro analýzu nepolárních a slabě polárních látek, je ale možné jí využít i k analýze silně kyselých, případně silně zásaditých látek. K těmto účelům se používá modifikací HPLC na reverzní fázi (RPLC), konkrétně IP-RPLC, kde retenci kyseliny (zásady) v reverzní fázi zvyšuje přítomnost protiiontu, odtud označení iontově párová – RPLC. Protiiontem pro kyselé látky bývá běžně např. octan amonný, pro zásady např. kyselina mravenčí. Jinou možností separace silně polárních látek jsou metody v provedení chromatografie na měničích iontů (IC-RPLC) (22,23).

Za obvyklých podmínek analýzy na reverzní fázi jsou nejvíce polární látky eluovány jako první, tedy diglykosidy předchází monoglykosidy a monoglykosidy předchází aglykony. Pro stejně substituované sloučeniny klesá intenzita afinity k mobilní fázi v pořadí flavanony > flavonoly > flavony. Chromatografické chování anthokyanů na koloně s reverzní fází je určeno celkovou polaritou a stereochemií sloučeniny. Klíčovými faktory jsou především charakter substituce B-kruhu flavanového skeletu, počet, poloha a druh sacharidických substituentů, případně míra jejich acylace. Tedy substituce B-kruhu určuje pořadí eluce jednotlivých látek jako delfinidin < kyanidin < petunidin < pelargonidin < peonidin < malvidin. Glykosylace celkově snižuje retenci v řadě 3,7-diglykosidy < 3,5-diglykosidy < 3-glykosidy a 3-galaktosidy < 3-glukosidy < 3-rutinosidy. Případná acetylace cukerných složek snižuje mobilitu sloučenin (21).

Dalluge a kol. (24) srovnával vhodnost šesti různých kolon a dvou mobilních fází pro analýzu čajových katechinů pomocí HPLC na reverzní fázi. Eluované látky byly detekovány spektrofotometricky při vlnové délce λ = 210 nm. Pro správné rozlišení látek za daných podmínek bylo nezbytné použít mobilní fáze (acetonitril-voda a acetonitril, methanol-voda) s přídavkem kyseliny trifluorooctové. Nejvyšší účinnosti dosahovaly deaktivované monomerní kolony s oktadecylsilylovou fází.

2.2.2.4 Detektory používané pro HPLC

Třemi základními variantami detekce pro kapalinovou chromatografii jsou:

  • A – optické detektory
  • B – hmotnostní detektor
  • C – elektrochemické detektory.
A Optické detektory

Dřívější detekce eluovaných látek byla založena především na sledování absorpce záření o charakteristické vlnové délce. Eluát zde obvykle protéká měrnou celou malého objemu s velkou optickou délkou, kde je při vhodné vlnové délce registrována absorbance eluátu. Zdrojem záření bývá obvykle deuteriová výbojka pro UV oblast a halogenová zářivka pro viditelnou oblast. Je možno výhodně využít nastavitelnosti jednokanálového snímače na různou vlnovou délku, případně použít mnohokanálové detekce. Pro skupinu anthokyanidinů a anthokyanů se jednalo o rozmezí 515–520 nm, ostatní flavonoidy byly detekovány v různých hodnotách UV-spektra, např. 280 nm pro flavanonové glykosidy. Většina flavonoidů vykazuje dvě hlavní skupiny absorpčních pásů: pás v rozmezí 320–385 nm vlivem absorpce B-kruhu a druhý pás v rozmezí 250–285 nm vlivem absorpce kruhu A (12, 27).

Značného rozšíření se dostalo detektoru s diodovým polem (diode-array detektor, DAD), který je schopen snímat spektra látek v širším vlnovém rozsahu a pro charakterizaci stanovovaných látek je tedy použito jak retenčního chování na koloně, tak jejich spektrálních vlastností. S narůstajícím počtem hydroxylových skupin molekuly dochází k posunu absorpčních maxim k viditelným oblastem světelného spektra (12).

Fluorimetrický detektor využívá funkce excitačního monochromátoru, který produkuje záření absorbované fluorescenčně aktivními látkami. Následné emitované záření je detekováno fotoelektrickým násobičem po průchodu emisním monochromátorem, lze tedy nezávisle měnit dva parametry: excitační i emisní vlnovou délku. Jednoznačnou předností fluorimetrického detektoru je jeho vysoká citlivost, v řadě případů je schopen detekovat eluovanou látku v koncentraci 10–1000x menší než fotometrický detektor. Použití fluorescenčního detektoru je ovšem omezeno pouze na látky, které vykazují přirozenou fluorescenci, nebo na nefluoreskující látky, které lze na fluoreskující sloučeniny převést vhodnou reakcí. Z fenolových látek jsou např. deriváty hydroxykumarinu, skopolin a umbelliferon schopny emitovat záření v rozmezí vlnové délky 450-460 nm.

B Hmotnostní detektor

Značné pozornosti si zasluhuje spojení HPLC s hmotnostním detektorem (MS), který je v podstatě univerzální a dovoluje přesnou identifikaci velkého množství látek. Nevýhodou hmotnostní spektrometrie jsou vysoké nároky na čistotu analytu, a dále potom velmi vysoké pořizovací a provozní náklady měřicí techniky. Nejčastějším způsobem ionizace bývá ionizace za atmosférického tlaku (API) ve dvou hlavních uspořádáních dle ionizačních zdrojů jako elektrospray (ESI) a chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI). Oba dva způsoby mohou vhodně sloužit k analýze širokého spektra látek. ESI patří mezi vysoce citlivé, šetrné ionizační techniky, je vhodná pro analýzu polárních, netěkavých, termolabilních sloučenin, jako jsou např. anthokyany. APCI je dalším zdokonalením electrospray ionizace, při kterém dochází k ionizaci odpařeného vzorku pomocí koronového výboje, analyzované látky získávají elektrický náboj chemickou ionizací. APCI byla použita např. pro stanovení isoflavonů (12, 19, 28, 29).

C Elektrochemická detekce

Pro analýzu polyfenolových látek je dále možno použít detekčních metod založených na měření elektrochemických reakcí. Rozlišení jednotlivých sloučenin je založeno na míře jejich oxidovatelnosti, která souvisí se změnami ve struktuře molekul jednotlivých polyfenolů, respektive s dostupností elektronů a schopností stabilizace náboje.

Dvěma nejběžnějšími možnostmi elektrochemické detekce v analýze polyfenolových látek jsou voltametrická a coulometrická detekce.

Voltametrický detektor: dovoluje zaznamenat velmi malé koncentrace organických látek v efluentu v těch případech, kdy jsou látky elektrochemicky redukovatelné nebo oxidovatelné. Princip detekce je založen na měření proudu mezi polarizovatelnou a měřenou elektrodou v závislosti na vloženém potenciálu. Často je tento detektor označován jako amperometrický detektor, neboť na elektrody se zpravidla vkládá konstantní potenciál a proud je měřen v závislosti na čase. Základní podmínkou voltametrického měření je dostatečná vodivost mobilní fáze (27).

Coulometrický detektor: při coulometrickém stanovení dochází ke kvantitativní oxidaci (případně redukci) analytu na pracovní elektrodě nebo kvantitativně reaguje s činidlem činidlem na elektrodě vzniklým. Elektroda bývá vyrobena z porézního grafitového materiálu. Při způsobu coulometrické analýzy za kontrolovaného potenciálu, kdy je na elektrochemickou celu vloženo konstantní napětí, je celkový náboj roven ploše pod křivkou závislosti proudu na čase. Látkové množství stanovovaného analytu se vypočte z Faradayova zákona. Proud probíhající celou je úměrný koncentraci redukovatelného (oxidovatelného) analytu a s probíhající reakcí klesá. Coulometrický detektor dosahuje vyšší selektivity a citlivosti vůči analytu (15, 25, 26, 27).

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

e-liquids, e-juices and nicotine liquids - Customized solutions for complete analysis

Brožury a specifikace
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Shimadzu Food Safety Management Data Book

Příručky
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC, GC/MSD, GC/SQ, HPLC, LC/MS, GPC, LC-SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Experience New Benchmarks with Empower Shimadzu’s LC/GC Drivers for Waters™ Empower™

Ostatní
| 2020 | Shimadzu
Instrumentace
Software
Výrobce
Shimadzu, Waters
Zaměření
---
 

Podobné články

Vědecký článek | Akademie

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

Článek se zabývá pokroky v kapalinové chromatografii. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívající principu separace na porézních částicích menších než 2 μm, byla využita při separaci a stanovení prostorových forem iso-α-hořkých látek v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Na reprezentativní skupině 11 vzorků chmele byla porovnána klasická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stále více rozšířenou ultra účinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC).
Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech
St, 30.9.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.

Pixabay/skeeze: Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech

Článek popisuje způsoby analytického stanovení polyfenolů v pivovarství. Metody pro toto stanovení jsou rozděleny do dvou skupin, analytické metody pro stanovení skupin polyfenolů a metody pro stanovení individuálních polyfenolů. Skupinové metody slouží ke stanovení anthokyanogenů, tanoidů a flavonoidů. Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.

1 ÚVOD

Polyfenoly jsou sekundární metabolity rostlin, které do piva přechází ze sladu a chmele. V průběhu pivovarského procesu dochází ke změnám jejich zastoupení a struktury a v řadě kroků ovlivňují technologický postup.

Mezi jejich nejdůležitější chemické vlastnosti patří schopnost reagovat s proteiny za tvorby výšemolekulárních komplexů a dále jejich antioxidační aktivita. Tvorba polyfenolbílkovinných komplexů negativně ovlivňuje koloidní stabilitu piva, zatímco redukční schopnost a schopnost vychytávání volných radikálů působí pozitivně na senzorickou stabilitu piva i na lidské zdraví.

Polyfenoly jakožto přirozené antioxidanty vyskytující se v potravě mohou snižovat pravděpodobnost výskytu některých civilizačních chorob konzumentů, v této souvislosti se uplatňují především antiaterosklerotické, antikarcinogenní, případně fytoestrogenní účinky některých polyfenolových látek.

Z uvedených důvodů jsou analytické metody stanovení polyfenolů předmětem výzkumu nejen pivovarských analytiků. Ačkoliv v minulosti se používala celá řada různorodých způsobů stanovení těchto látek, dnes analýze dominuje především vysokoúčinná kapalinová chromatografie se spektrofotometrickou, hmotnostní nebo elektrochemickou detekcí. Aktuálním problémem stanovení je izolace, přečištění a zakoncentrování analyzovaných látek z vysoce komplexní přírodní matrice.

2 ANALYTICKÉ METODY PRO STANOVENÍ POLYFENOLŮ

Metody používané v analýze polyfenolových látek je možno v současné době rozdělit do dvou hlavních částí. První z nich využívá společných vlastností větších či menších skupin polyfenolových sloučenin a jedná se tedy o metody skupinové.

Analytickým metodám pro stanovení jednotlivých polyfenolových látek dominuje HPLC (High Performance Liquid Chromatography – vysokoúčinná kapalinová chromatografie) na reverzní fázi s různými možnostmi detekce UV-VIS, DAD (detektor s diodovým polem), MS (hmotnostní detektor). Staršími možnostmi jsou kapilární plynová chromatografie (CGC), papírová chromatografie (PC), chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a podobně (1).

2.1 Skupinové analytické metody
Stanovení celkových polyfenolů metodou EBC:

Tato metoda je založena na reakci polyfenolů s trojmocnými ionty železa v alkalickém prostředí, při které dochází k tvorbě červeně zbarveného komplexu. Intenzita vzniklého zbarvení je měřena spektrofotometricky při vlnové délce λ = 600 nm proti slepému pokusu. Výsledek je dán vzorcem a uvádí se v miligramech na litr (2).

Stanovení anthokyanogenů podle Harrise a Ricketse:

V této metodě jsou polyfenolové látky vzorku nejprve adsorbovány polyamidovým práškem, zachycené látky jsou potom z adsorbentu uvolněny za tepla působením směsi butanol-chlorovodíkové kyseliny. Intenzita zbarvení vzniklých oxoniových solí je určena spektrofotometricky při λ = 550 nm proti slepému pokusu. Závislost obsahu anthokyanogenů na naměřené absorbanci je tabelována a výsledky je možno odečíst z tabulky (3).

Stanovení tanoidů podle Chapona:

Metoda je založena na principu tvorby komplexů polyfenolů s polyvinylpyrrolidonem (PVP).Do roztoku obsahujícího tanoidy se dávkuje polyvinylpyrrolidon (PVP). Vzniká zákal, jehož intenzita se zvyšuje tak dlouho, než se všechny tanoidy adsorbují. Množství PVP, které se musí přidat k dosažení maxima zákalu, je proporcionální obsahu tanoidů. Vzniklý zákal se změří nefelometricky. Výsledek je dán vzorcem a je vyjádřen v miligramech PVP na litr (3).

Stanovení flavanoidů:

V kyselém prostředí reagují flavanoidy s chromogenem pdimethylaminocinnamaldehydem za vzniku barevných pigmentů. Metoda dovoluje kvantitativní stanovení např. katechinu a proanthokyanidinu. Vzorek se smíchá s kyselou solucí chromogenu a výsledná intenzita zbarvení je proměřena spektrofotometricky při vlnové délce λ = 640 nm. Výsledek je dán vzorcem a je vyjádřen v katechinových ekvivalentech v miligramech na litr (2).

2.2 Analytické metody pro stanovení jednotlivých polyfenolů

Volby jednotlivých analytických kroků pro stanovení jednotlivých polyfenolů jsou shrnuty v následující části. Extrakce a zakoncentrování stanovovaných látek bývá běžně provedeno v jednom kroku, dále se někdy zavádí frakcionace polyfenolů na fenolové kyseliny a neutrální látky.

2.2.1 Extrakce, zakoncentrování a purifikace

Nízká hladina polyfenolových látek v analyzovaném materiálu často vyžaduje provedení vhodné extrakce vedoucí k získání zakoncentrovaného podílu analyzovaných látek s redukovaným obsahem interferujících příměsí. Vzhledem ke značné složitosti chromatogramů extraktů polyfenolů z HPLC, zavádí někteří autoři analytické kroky vedoucí k frakcionaci polyfenolových látek nejčastěji na základě rozdílné disociační konstanty (4,5).

Z hlediska provedení se dají jednotlivé metody extrakce rozdělit do dvou následujících skupin: LLE (Liquid-liquid extraction – extrakce kapalina-kapalina) a SPE (Solid Phase Extraction – extrakce na pevné fázi). Např. Bendini a kol. 6 se zabývali porovnáním výtěžností extrahovaných látek z olivového oleje pomocí SPE a LLE. Pirisi a kol. (7) se také zabývají srovnáním SPE s C18 a C8 náplní a LLE s hexanem. Kvantifikace zachycených sloučenin byla provedena pomocí HPLC-DAD-MS a CZE (kapilární zónová elektroforéza) s UV-VIS detekcí. Pořadí jednotlivých metod dle klesající výtěžnosti bylo LLE, C18 a C8-SPE.

Extrakční a čisticí kroky obecně prodlužují dobu analýzy, Cappanesi a kol. 8 uvádí alternativní možnost detekce pomocí biosenzoru, založené na tyrosinasové oxidaci polyfenolových sloučenin, která nevyžaduje předcházející úpravu vzorku.

2.2.1.1 Kapalinová extrakce – (LLE – Liquid-liquid extraction)

V potravinářské analýze polyfenolových látek existuje velká variabilita různých analyzovaných materiálů, přesto se pro účely kapalinové extrakce používá relativně malé množství extrakčních činidel, a to buď samotných, nebo ve vzájemné kombinaci.

Tradičními běžně používanými rozpouštědly jsou horká voda, methanol, ethanol, aceton, a ethylacetát, který se vyskytuje nejčastěji. Vzácněji jsou používána jiná rozpouštědla, např. acetonitril, DMF (dimethylformamid) a chloroform (5, 9).

Extrakce je z důvodu dosažení maximálního výtěžku často prováděna za nepřístupu světla, kyslíku, s přídavkem umělých antioxidantů apod. Mechanická úprava vzorku bývá použita k zamezení molekulárních interakcí, respektive k podpoře uvolnění látek z vázaných forem. Nejčastějším provedením extrakce fenolových kyselin bývá opakovaná Soxhlethova extrakce trvající v jednom kroku jednu až šest hodin (1).

Extrakce flavonoidů a jednoduchých fenolových kyselin probíhá obdobně, rozdělovacím faktorem je pH, čehož lze využít pro oddělení těchto dvou frakcí. Frakcionaci je tedy možné provést např. kapalinovou extrakcí ethylacetátem při pH 7 a při pH 2, případně zádrží na C18 koloně a elucí roztoky o různém pH. Jinou možností rozdělení polyfenolů na fenolové kyseliny a neutrální látky může být frakcionace pomocí iontovýměnné chromatografie na silném anexu (1, 10).

Z jiných možností např. Chang a kol. (11) uvádí možnost použití nadkritické fluidní extrakce oxidem uhličitým pro izolaci polyfenolových látek zeleného čaje.

2.2.1.2 Extrakce na pevné fázi – (SPE)

K tomuto druhu extrakce se nejčastěji používá chromatografických náplňových kolon s řadou adsorpčních materiálů, jako jsou polyamidové materiály, PVPP, Sephadex, modifikovaný silikagel, mikrokrystalická celulosa a další. S extrakčním krokem analýzy zde bývá často spojeno i přečištění analytu, případně frakcionace jednotlivých skupin polyfenolových látek. Silikagel je zvláště vhodný pro analýzu méně polárních isoflavonů, flavanonů, flavonů a flavonolových glykosidů. K modifikaci vnitřního povrchu silikagelové náplně kolon se používají obdobné funkční skupiny jako v případě kolon pro HPLC na reverzní fázi (C8, C18, DIOL). Naproti tomu polyamid je adsorbent vhodný pro separaci flavonoidů o různé polaritě, zvláště pak glykosidů (12). Minikolonky s náplní polyamidu 6 byly použity k frakcionaci flavonolů z červené malinové šťávy. První část flavonoidů, která byla získaná elucí methanolem, obsahovala glykosidy kvercetinu, kvercetin a kempferol. Druhá část byla z kolony vymyta mobilní fází skládající se z 0,5% roztoku amoniaku v methanolu a obsahovala flavonolové glukuronidy, aglykony, kyselinu ellagovou a její deriváty (13).

Např. Mc Murrough a kol. (14) uvádějí extrakci směsí aceton/voda, odpaření rozpouštědla, rozpuštění zbytku v ethanolu a následnou frakcionaci polyfenolů na koloně s náplní Sephadex.

García a kol. (5) uvádí metodu zakoncentrování na C18 Sep-Pak koloně kondicionované methanolem a promyté vodou. Po nanesení a eluci okyseleného vzorku byla kolona vysušena dusíkem. Zachycené fenolové látky byly eluovány acetonitrilem a po odpaření rozpouštědla na vakuové odparce opět rozpuštěny ve směsi methanol/voda (1:1) s 1 % kyseliny sírové. Oddělení flavanových glykosidů od flavonolů nebo flavonových glykosidů je obvykle obtížné, ale může být provedeno na celulosových kolonách s vodou jako promývacím roztokem (15).

2.2.2 Chromatografické metody a detekce látek

Mezi starší metody analýzy polyfenolů v potravinách patří jednoduchá provedení chromatografických metod. Do této skupiny patří např. papírová chromatografie (PC), používající jako stacionární fázi chromatografický papír.

Z dalších dříve značně využívaných metod je možno zmínit např. chromatografii na tenké vrstvě (TLC) s různými možnostmi stacionární fáze (silikagel, celulosa, polyamid). Výběr pevné fáze závisí na skupině flavonoidů, která má býti analyzována, hydrofilní flavonoidy mohou být snadno separovány pomocí TLC na polyamidu nebo mikrokrystalické celulose. Silikagel bývá používán při TLC analýze méně hydrofilních látek jako jsou flavony a isoflavony. Detekce separovaných skupin analytů je prováděna reakcí s činidly za tvorby barevných komplexů, případně tvorby fluoreskujících komplexů. Chromatografie na tenké vrstvě je finančně a časově nenáročná, její hlavní nevýhodou je omezená možnost kvantifikace a nízká výtěžnost (1, 13, 17).

2.2.2.1 Kapilární zónová elektroforéza – (CZE)

CZE je vysoce účinná metoda, při které dochází k separaci látek na krátké křemenné kapiláře s průměrem od 50–100 μm. Jedná se o poměrně rychlou a levnou metodu, která může dosáhnout lepší selektivity než analýza pomocí HPLC (9). Separaci kromě parametrů kapiláry ovlivňuje navíc pH a také organické látky, které se používají jako modifikátory v nosných elektrolytech. Tato rozpouštědla ovlivňují pohyblivost analytu snížením polarity pufru, mohou zlepšit selektivitu a tím zvýšit pravděpodobnost identifikace analyzovaných látek (18). CZE umožňuje paralelní stanovení široké škály nabitých látek, zatímco sloučeniny bez náboje jsou odnášeny elektroosmotickým tokem bez separace. Molekuly flavonoidů obsahují elektrický náboj v alkalickém prostředí. Aby nedošlo k zahlcení kapiláry, bývá objem analyzovaného vzorku velmi nízký (13).

Na rozhraní mezi elektroforetickými a chromatografickými metodami se pohybuje micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC).

2.2.2.2 Plynová chromatografie – (GC)

Základním problémem použití této analytické metody je nízká těkavost fenolových sloučenin. Z tohoto důvodu se její využití omezuje především na stanovení jednoduchých fenolových kyselin a nízkomolekulárních flavonoidů. Hydroxylové skupiny je nutno převést na ethery, případně estery. K derivatizaci bývá nejčastěji použita trialkylsilylová skupina, nejčastěji v podobě trimethylsilylových derivátů. Nejběžněji používanými silylačními činidly pro derivatizaci fenolových kyselin jsou N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamid, N-metyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid a N,O-bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid. Pro vlastní chromatografické rozdělení jsou nejčastěji použity kapilární kolony z taveného křemene o délce 25–30 m, vnitřním průměru 0,25–0,5 mm a tloušťce vnitřní vrstvy (stacionární fáze) 0,25 μm. Jako příklad používané stacionární fáze je možno uvést polysiloxanový materiál DB-5, který obsahuje 95 % methylových a 5% fenylových substituentů.

K detekci byl dříve běžně používán plamenově ionizační detektor (FID), dnes převládá spojení plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) v uspořádání s ionizací nárazem elektronu (EI) (1, 19).

2.2.2.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – (HPLC)

Nejpoužívanější současnou metodou pro stanovení polyfenolových látek je vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi.

Kolony používané v HPLC analýze bývají 10–100 cm dlouhé (nejčastěji 10–25 cm), jejich vnitřní průměr se obvykle pohybuje v rozmezí od 0,2 do 5 mm. U přírodních vzorků obsahujících větší množství balastních látek, které by mohly vyvolat předčasné znehodnocení kolony, bývá často před vlastní kolonou zařazena ochranná předkolonka. Jako chemicky vázané stacionární nepolární skupiny pro reverzní fázi se nejčastěji používají C8H17–, C18H37– a méně často fenyl. Tyto skupiny jsou obvykle vázány na vrstvu silikagelu. Pro takto hydrofobizovanou stacionární fázi se používá spíše polárních mobilních fází na bázi binárních až ternárních směsí vody, methanolu, acetonitrilu, THF (tetrahydrofuran) či dioxanu. Retenční poměry řady látek se dají ovlivnit změnou pH mobilní fáze (např. zvýšením pH mobilní fáze se zvyšují retenční časy bazických látek a snižují retenční časy kyselých složek) (16, 20).

V analýze fenolových látek je téměř výhradně používána stacionární fáze C18 s vnitřním průměrem kolony od 2 do 5 mm (HPLC ve spojení s hmotnostní detekcí využívá menších průměrů). Velikost částic bývá většinou 3 až 5 μm. Nejčastěji se používá lineární gradientová eluce, mobilní fáze se skládá z polární a nepolární části, někdy obsahuje i roztoky s pufrační kapacitou. Vodná fáze obsahuje často přídavek kyseliny octové, používaná organická rozpouštědla v nepolární fázi jsou methanol, acetonitril, propanol, butanol, THF, ethylacetát a další. Volba mobilní fáze a její pH závisí na druhu použité stacionární fáze. Mobilní fáze obsahují často příměsi organických kyselin (nejčastěji kyselina octová) pro zvýšení retence slabě kyselých látek, případně příměsi slabých zásad pro zvýšení retence slabě zásaditých látek. Eluce bývá obvykle prováděna s binárním lineárním gradientem (1, 21).

HPLC s reverzní stacionární fází je používána především pro analýzu nepolárních a slabě polárních látek, je ale možné jí využít i k analýze silně kyselých, případně silně zásaditých látek. K těmto účelům se používá modifikací HPLC na reverzní fázi (RPLC), konkrétně IP-RPLC, kde retenci kyseliny (zásady) v reverzní fázi zvyšuje přítomnost protiiontu, odtud označení iontově párová – RPLC. Protiiontem pro kyselé látky bývá běžně např. octan amonný, pro zásady např. kyselina mravenčí. Jinou možností separace silně polárních látek jsou metody v provedení chromatografie na měničích iontů (IC-RPLC) (22,23).

Za obvyklých podmínek analýzy na reverzní fázi jsou nejvíce polární látky eluovány jako první, tedy diglykosidy předchází monoglykosidy a monoglykosidy předchází aglykony. Pro stejně substituované sloučeniny klesá intenzita afinity k mobilní fázi v pořadí flavanony > flavonoly > flavony. Chromatografické chování anthokyanů na koloně s reverzní fází je určeno celkovou polaritou a stereochemií sloučeniny. Klíčovými faktory jsou především charakter substituce B-kruhu flavanového skeletu, počet, poloha a druh sacharidických substituentů, případně míra jejich acylace. Tedy substituce B-kruhu určuje pořadí eluce jednotlivých látek jako delfinidin < kyanidin < petunidin < pelargonidin < peonidin < malvidin. Glykosylace celkově snižuje retenci v řadě 3,7-diglykosidy < 3,5-diglykosidy < 3-glykosidy a 3-galaktosidy < 3-glukosidy < 3-rutinosidy. Případná acetylace cukerných složek snižuje mobilitu sloučenin (21).

Dalluge a kol. (24) srovnával vhodnost šesti různých kolon a dvou mobilních fází pro analýzu čajových katechinů pomocí HPLC na reverzní fázi. Eluované látky byly detekovány spektrofotometricky při vlnové délce λ = 210 nm. Pro správné rozlišení látek za daných podmínek bylo nezbytné použít mobilní fáze (acetonitril-voda a acetonitril, methanol-voda) s přídavkem kyseliny trifluorooctové. Nejvyšší účinnosti dosahovaly deaktivované monomerní kolony s oktadecylsilylovou fází.

2.2.2.4 Detektory používané pro HPLC

Třemi základními variantami detekce pro kapalinovou chromatografii jsou:

  • A – optické detektory
  • B – hmotnostní detektor
  • C – elektrochemické detektory.
A Optické detektory

Dřívější detekce eluovaných látek byla založena především na sledování absorpce záření o charakteristické vlnové délce. Eluát zde obvykle protéká měrnou celou malého objemu s velkou optickou délkou, kde je při vhodné vlnové délce registrována absorbance eluátu. Zdrojem záření bývá obvykle deuteriová výbojka pro UV oblast a halogenová zářivka pro viditelnou oblast. Je možno výhodně využít nastavitelnosti jednokanálového snímače na různou vlnovou délku, případně použít mnohokanálové detekce. Pro skupinu anthokyanidinů a anthokyanů se jednalo o rozmezí 515–520 nm, ostatní flavonoidy byly detekovány v různých hodnotách UV-spektra, např. 280 nm pro flavanonové glykosidy. Většina flavonoidů vykazuje dvě hlavní skupiny absorpčních pásů: pás v rozmezí 320–385 nm vlivem absorpce B-kruhu a druhý pás v rozmezí 250–285 nm vlivem absorpce kruhu A (12, 27).

Značného rozšíření se dostalo detektoru s diodovým polem (diode-array detektor, DAD), který je schopen snímat spektra látek v širším vlnovém rozsahu a pro charakterizaci stanovovaných látek je tedy použito jak retenčního chování na koloně, tak jejich spektrálních vlastností. S narůstajícím počtem hydroxylových skupin molekuly dochází k posunu absorpčních maxim k viditelným oblastem světelného spektra (12).

Fluorimetrický detektor využívá funkce excitačního monochromátoru, který produkuje záření absorbované fluorescenčně aktivními látkami. Následné emitované záření je detekováno fotoelektrickým násobičem po průchodu emisním monochromátorem, lze tedy nezávisle měnit dva parametry: excitační i emisní vlnovou délku. Jednoznačnou předností fluorimetrického detektoru je jeho vysoká citlivost, v řadě případů je schopen detekovat eluovanou látku v koncentraci 10–1000x menší než fotometrický detektor. Použití fluorescenčního detektoru je ovšem omezeno pouze na látky, které vykazují přirozenou fluorescenci, nebo na nefluoreskující látky, které lze na fluoreskující sloučeniny převést vhodnou reakcí. Z fenolových látek jsou např. deriváty hydroxykumarinu, skopolin a umbelliferon schopny emitovat záření v rozmezí vlnové délky 450-460 nm.

B Hmotnostní detektor

Značné pozornosti si zasluhuje spojení HPLC s hmotnostním detektorem (MS), který je v podstatě univerzální a dovoluje přesnou identifikaci velkého množství látek. Nevýhodou hmotnostní spektrometrie jsou vysoké nároky na čistotu analytu, a dále potom velmi vysoké pořizovací a provozní náklady měřicí techniky. Nejčastějším způsobem ionizace bývá ionizace za atmosférického tlaku (API) ve dvou hlavních uspořádáních dle ionizačních zdrojů jako elektrospray (ESI) a chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI). Oba dva způsoby mohou vhodně sloužit k analýze širokého spektra látek. ESI patří mezi vysoce citlivé, šetrné ionizační techniky, je vhodná pro analýzu polárních, netěkavých, termolabilních sloučenin, jako jsou např. anthokyany. APCI je dalším zdokonalením electrospray ionizace, při kterém dochází k ionizaci odpařeného vzorku pomocí koronového výboje, analyzované látky získávají elektrický náboj chemickou ionizací. APCI byla použita např. pro stanovení isoflavonů (12, 19, 28, 29).

C Elektrochemická detekce

Pro analýzu polyfenolových látek je dále možno použít detekčních metod založených na měření elektrochemických reakcí. Rozlišení jednotlivých sloučenin je založeno na míře jejich oxidovatelnosti, která souvisí se změnami ve struktuře molekul jednotlivých polyfenolů, respektive s dostupností elektronů a schopností stabilizace náboje.

Dvěma nejběžnějšími možnostmi elektrochemické detekce v analýze polyfenolových látek jsou voltametrická a coulometrická detekce.

Voltametrický detektor: dovoluje zaznamenat velmi malé koncentrace organických látek v efluentu v těch případech, kdy jsou látky elektrochemicky redukovatelné nebo oxidovatelné. Princip detekce je založen na měření proudu mezi polarizovatelnou a měřenou elektrodou v závislosti na vloženém potenciálu. Často je tento detektor označován jako amperometrický detektor, neboť na elektrody se zpravidla vkládá konstantní potenciál a proud je měřen v závislosti na čase. Základní podmínkou voltametrického měření je dostatečná vodivost mobilní fáze (27).

Coulometrický detektor: při coulometrickém stanovení dochází ke kvantitativní oxidaci (případně redukci) analytu na pracovní elektrodě nebo kvantitativně reaguje s činidlem činidlem na elektrodě vzniklým. Elektroda bývá vyrobena z porézního grafitového materiálu. Při způsobu coulometrické analýzy za kontrolovaného potenciálu, kdy je na elektrochemickou celu vloženo konstantní napětí, je celkový náboj roven ploše pod křivkou závislosti proudu na čase. Látkové množství stanovovaného analytu se vypočte z Faradayova zákona. Proud probíhající celou je úměrný koncentraci redukovatelného (oxidovatelného) analytu a s probíhající reakcí klesá. Coulometrický detektor dosahuje vyšší selektivity a citlivosti vůči analytu (15, 25, 26, 27).

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

e-liquids, e-juices and nicotine liquids - Customized solutions for complete analysis

Brožury a specifikace
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Shimadzu Food Safety Management Data Book

Příručky
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC, GC/MSD, GC/SQ, HPLC, LC/MS, GPC, LC-SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Experience New Benchmarks with Empower Shimadzu’s LC/GC Drivers for Waters™ Empower™

Ostatní
| 2020 | Shimadzu
Instrumentace
Software
Výrobce
Shimadzu, Waters
Zaměření
---
 

Podobné články

Vědecký článek | Akademie

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

Článek se zabývá pokroky v kapalinové chromatografii. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívající principu separace na porézních částicích menších než 2 μm, byla využita při separaci a stanovení prostorových forem iso-α-hořkých látek v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Na reprezentativní skupině 11 vzorků chmele byla porovnána klasická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stále více rozšířenou ultra účinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC).
Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech
St, 30.9.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.

Pixabay/skeeze: Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech

Článek popisuje způsoby analytického stanovení polyfenolů v pivovarství. Metody pro toto stanovení jsou rozděleny do dvou skupin, analytické metody pro stanovení skupin polyfenolů a metody pro stanovení individuálních polyfenolů. Skupinové metody slouží ke stanovení anthokyanogenů, tanoidů a flavonoidů. Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.

1 ÚVOD

Polyfenoly jsou sekundární metabolity rostlin, které do piva přechází ze sladu a chmele. V průběhu pivovarského procesu dochází ke změnám jejich zastoupení a struktury a v řadě kroků ovlivňují technologický postup.

Mezi jejich nejdůležitější chemické vlastnosti patří schopnost reagovat s proteiny za tvorby výšemolekulárních komplexů a dále jejich antioxidační aktivita. Tvorba polyfenolbílkovinných komplexů negativně ovlivňuje koloidní stabilitu piva, zatímco redukční schopnost a schopnost vychytávání volných radikálů působí pozitivně na senzorickou stabilitu piva i na lidské zdraví.

Polyfenoly jakožto přirozené antioxidanty vyskytující se v potravě mohou snižovat pravděpodobnost výskytu některých civilizačních chorob konzumentů, v této souvislosti se uplatňují především antiaterosklerotické, antikarcinogenní, případně fytoestrogenní účinky některých polyfenolových látek.

Z uvedených důvodů jsou analytické metody stanovení polyfenolů předmětem výzkumu nejen pivovarských analytiků. Ačkoliv v minulosti se používala celá řada různorodých způsobů stanovení těchto látek, dnes analýze dominuje především vysokoúčinná kapalinová chromatografie se spektrofotometrickou, hmotnostní nebo elektrochemickou detekcí. Aktuálním problémem stanovení je izolace, přečištění a zakoncentrování analyzovaných látek z vysoce komplexní přírodní matrice.

2 ANALYTICKÉ METODY PRO STANOVENÍ POLYFENOLŮ

Metody používané v analýze polyfenolových látek je možno v současné době rozdělit do dvou hlavních částí. První z nich využívá společných vlastností větších či menších skupin polyfenolových sloučenin a jedná se tedy o metody skupinové.

Analytickým metodám pro stanovení jednotlivých polyfenolových látek dominuje HPLC (High Performance Liquid Chromatography – vysokoúčinná kapalinová chromatografie) na reverzní fázi s různými možnostmi detekce UV-VIS, DAD (detektor s diodovým polem), MS (hmotnostní detektor). Staršími možnostmi jsou kapilární plynová chromatografie (CGC), papírová chromatografie (PC), chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a podobně (1).

2.1 Skupinové analytické metody
Stanovení celkových polyfenolů metodou EBC:

Tato metoda je založena na reakci polyfenolů s trojmocnými ionty železa v alkalickém prostředí, při které dochází k tvorbě červeně zbarveného komplexu. Intenzita vzniklého zbarvení je měřena spektrofotometricky při vlnové délce λ = 600 nm proti slepému pokusu. Výsledek je dán vzorcem a uvádí se v miligramech na litr (2).

Stanovení anthokyanogenů podle Harrise a Ricketse:

V této metodě jsou polyfenolové látky vzorku nejprve adsorbovány polyamidovým práškem, zachycené látky jsou potom z adsorbentu uvolněny za tepla působením směsi butanol-chlorovodíkové kyseliny. Intenzita zbarvení vzniklých oxoniových solí je určena spektrofotometricky při λ = 550 nm proti slepému pokusu. Závislost obsahu anthokyanogenů na naměřené absorbanci je tabelována a výsledky je možno odečíst z tabulky (3).

Stanovení tanoidů podle Chapona:

Metoda je založena na principu tvorby komplexů polyfenolů s polyvinylpyrrolidonem (PVP).Do roztoku obsahujícího tanoidy se dávkuje polyvinylpyrrolidon (PVP). Vzniká zákal, jehož intenzita se zvyšuje tak dlouho, než se všechny tanoidy adsorbují. Množství PVP, které se musí přidat k dosažení maxima zákalu, je proporcionální obsahu tanoidů. Vzniklý zákal se změří nefelometricky. Výsledek je dán vzorcem a je vyjádřen v miligramech PVP na litr (3).

Stanovení flavanoidů:

V kyselém prostředí reagují flavanoidy s chromogenem pdimethylaminocinnamaldehydem za vzniku barevných pigmentů. Metoda dovoluje kvantitativní stanovení např. katechinu a proanthokyanidinu. Vzorek se smíchá s kyselou solucí chromogenu a výsledná intenzita zbarvení je proměřena spektrofotometricky při vlnové délce λ = 640 nm. Výsledek je dán vzorcem a je vyjádřen v katechinových ekvivalentech v miligramech na litr (2).

2.2 Analytické metody pro stanovení jednotlivých polyfenolů

Volby jednotlivých analytických kroků pro stanovení jednotlivých polyfenolů jsou shrnuty v následující části. Extrakce a zakoncentrování stanovovaných látek bývá běžně provedeno v jednom kroku, dále se někdy zavádí frakcionace polyfenolů na fenolové kyseliny a neutrální látky.

2.2.1 Extrakce, zakoncentrování a purifikace

Nízká hladina polyfenolových látek v analyzovaném materiálu často vyžaduje provedení vhodné extrakce vedoucí k získání zakoncentrovaného podílu analyzovaných látek s redukovaným obsahem interferujících příměsí. Vzhledem ke značné složitosti chromatogramů extraktů polyfenolů z HPLC, zavádí někteří autoři analytické kroky vedoucí k frakcionaci polyfenolových látek nejčastěji na základě rozdílné disociační konstanty (4,5).

Z hlediska provedení se dají jednotlivé metody extrakce rozdělit do dvou následujících skupin: LLE (Liquid-liquid extraction – extrakce kapalina-kapalina) a SPE (Solid Phase Extraction – extrakce na pevné fázi). Např. Bendini a kol. 6 se zabývali porovnáním výtěžností extrahovaných látek z olivového oleje pomocí SPE a LLE. Pirisi a kol. (7) se také zabývají srovnáním SPE s C18 a C8 náplní a LLE s hexanem. Kvantifikace zachycených sloučenin byla provedena pomocí HPLC-DAD-MS a CZE (kapilární zónová elektroforéza) s UV-VIS detekcí. Pořadí jednotlivých metod dle klesající výtěžnosti bylo LLE, C18 a C8-SPE.

Extrakční a čisticí kroky obecně prodlužují dobu analýzy, Cappanesi a kol. 8 uvádí alternativní možnost detekce pomocí biosenzoru, založené na tyrosinasové oxidaci polyfenolových sloučenin, která nevyžaduje předcházející úpravu vzorku.

2.2.1.1 Kapalinová extrakce – (LLE – Liquid-liquid extraction)

V potravinářské analýze polyfenolových látek existuje velká variabilita různých analyzovaných materiálů, přesto se pro účely kapalinové extrakce používá relativně malé množství extrakčních činidel, a to buď samotných, nebo ve vzájemné kombinaci.

Tradičními běžně používanými rozpouštědly jsou horká voda, methanol, ethanol, aceton, a ethylacetát, který se vyskytuje nejčastěji. Vzácněji jsou používána jiná rozpouštědla, např. acetonitril, DMF (dimethylformamid) a chloroform (5, 9).

Extrakce je z důvodu dosažení maximálního výtěžku často prováděna za nepřístupu světla, kyslíku, s přídavkem umělých antioxidantů apod. Mechanická úprava vzorku bývá použita k zamezení molekulárních interakcí, respektive k podpoře uvolnění látek z vázaných forem. Nejčastějším provedením extrakce fenolových kyselin bývá opakovaná Soxhlethova extrakce trvající v jednom kroku jednu až šest hodin (1).

Extrakce flavonoidů a jednoduchých fenolových kyselin probíhá obdobně, rozdělovacím faktorem je pH, čehož lze využít pro oddělení těchto dvou frakcí. Frakcionaci je tedy možné provést např. kapalinovou extrakcí ethylacetátem při pH 7 a při pH 2, případně zádrží na C18 koloně a elucí roztoky o různém pH. Jinou možností rozdělení polyfenolů na fenolové kyseliny a neutrální látky může být frakcionace pomocí iontovýměnné chromatografie na silném anexu (1, 10).

Z jiných možností např. Chang a kol. (11) uvádí možnost použití nadkritické fluidní extrakce oxidem uhličitým pro izolaci polyfenolových látek zeleného čaje.

2.2.1.2 Extrakce na pevné fázi – (SPE)

K tomuto druhu extrakce se nejčastěji používá chromatografických náplňových kolon s řadou adsorpčních materiálů, jako jsou polyamidové materiály, PVPP, Sephadex, modifikovaný silikagel, mikrokrystalická celulosa a další. S extrakčním krokem analýzy zde bývá často spojeno i přečištění analytu, případně frakcionace jednotlivých skupin polyfenolových látek. Silikagel je zvláště vhodný pro analýzu méně polárních isoflavonů, flavanonů, flavonů a flavonolových glykosidů. K modifikaci vnitřního povrchu silikagelové náplně kolon se používají obdobné funkční skupiny jako v případě kolon pro HPLC na reverzní fázi (C8, C18, DIOL). Naproti tomu polyamid je adsorbent vhodný pro separaci flavonoidů o různé polaritě, zvláště pak glykosidů (12). Minikolonky s náplní polyamidu 6 byly použity k frakcionaci flavonolů z červené malinové šťávy. První část flavonoidů, která byla získaná elucí methanolem, obsahovala glykosidy kvercetinu, kvercetin a kempferol. Druhá část byla z kolony vymyta mobilní fází skládající se z 0,5% roztoku amoniaku v methanolu a obsahovala flavonolové glukuronidy, aglykony, kyselinu ellagovou a její deriváty (13).

Např. Mc Murrough a kol. (14) uvádějí extrakci směsí aceton/voda, odpaření rozpouštědla, rozpuštění zbytku v ethanolu a následnou frakcionaci polyfenolů na koloně s náplní Sephadex.

García a kol. (5) uvádí metodu zakoncentrování na C18 Sep-Pak koloně kondicionované methanolem a promyté vodou. Po nanesení a eluci okyseleného vzorku byla kolona vysušena dusíkem. Zachycené fenolové látky byly eluovány acetonitrilem a po odpaření rozpouštědla na vakuové odparce opět rozpuštěny ve směsi methanol/voda (1:1) s 1 % kyseliny sírové. Oddělení flavanových glykosidů od flavonolů nebo flavonových glykosidů je obvykle obtížné, ale může být provedeno na celulosových kolonách s vodou jako promývacím roztokem (15).

2.2.2 Chromatografické metody a detekce látek

Mezi starší metody analýzy polyfenolů v potravinách patří jednoduchá provedení chromatografických metod. Do této skupiny patří např. papírová chromatografie (PC), používající jako stacionární fázi chromatografický papír.

Z dalších dříve značně využívaných metod je možno zmínit např. chromatografii na tenké vrstvě (TLC) s různými možnostmi stacionární fáze (silikagel, celulosa, polyamid). Výběr pevné fáze závisí na skupině flavonoidů, která má býti analyzována, hydrofilní flavonoidy mohou být snadno separovány pomocí TLC na polyamidu nebo mikrokrystalické celulose. Silikagel bývá používán při TLC analýze méně hydrofilních látek jako jsou flavony a isoflavony. Detekce separovaných skupin analytů je prováděna reakcí s činidly za tvorby barevných komplexů, případně tvorby fluoreskujících komplexů. Chromatografie na tenké vrstvě je finančně a časově nenáročná, její hlavní nevýhodou je omezená možnost kvantifikace a nízká výtěžnost (1, 13, 17).

2.2.2.1 Kapilární zónová elektroforéza – (CZE)

CZE je vysoce účinná metoda, při které dochází k separaci látek na krátké křemenné kapiláře s průměrem od 50–100 μm. Jedná se o poměrně rychlou a levnou metodu, která může dosáhnout lepší selektivity než analýza pomocí HPLC (9). Separaci kromě parametrů kapiláry ovlivňuje navíc pH a také organické látky, které se používají jako modifikátory v nosných elektrolytech. Tato rozpouštědla ovlivňují pohyblivost analytu snížením polarity pufru, mohou zlepšit selektivitu a tím zvýšit pravděpodobnost identifikace analyzovaných látek (18). CZE umožňuje paralelní stanovení široké škály nabitých látek, zatímco sloučeniny bez náboje jsou odnášeny elektroosmotickým tokem bez separace. Molekuly flavonoidů obsahují elektrický náboj v alkalickém prostředí. Aby nedošlo k zahlcení kapiláry, bývá objem analyzovaného vzorku velmi nízký (13).

Na rozhraní mezi elektroforetickými a chromatografickými metodami se pohybuje micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC).

2.2.2.2 Plynová chromatografie – (GC)

Základním problémem použití této analytické metody je nízká těkavost fenolových sloučenin. Z tohoto důvodu se její využití omezuje především na stanovení jednoduchých fenolových kyselin a nízkomolekulárních flavonoidů. Hydroxylové skupiny je nutno převést na ethery, případně estery. K derivatizaci bývá nejčastěji použita trialkylsilylová skupina, nejčastěji v podobě trimethylsilylových derivátů. Nejběžněji používanými silylačními činidly pro derivatizaci fenolových kyselin jsou N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamid, N-metyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid a N,O-bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid. Pro vlastní chromatografické rozdělení jsou nejčastěji použity kapilární kolony z taveného křemene o délce 25–30 m, vnitřním průměru 0,25–0,5 mm a tloušťce vnitřní vrstvy (stacionární fáze) 0,25 μm. Jako příklad používané stacionární fáze je možno uvést polysiloxanový materiál DB-5, který obsahuje 95 % methylových a 5% fenylových substituentů.

K detekci byl dříve běžně používán plamenově ionizační detektor (FID), dnes převládá spojení plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) v uspořádání s ionizací nárazem elektronu (EI) (1, 19).

2.2.2.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – (HPLC)

Nejpoužívanější současnou metodou pro stanovení polyfenolových látek je vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi.

Kolony používané v HPLC analýze bývají 10–100 cm dlouhé (nejčastěji 10–25 cm), jejich vnitřní průměr se obvykle pohybuje v rozmezí od 0,2 do 5 mm. U přírodních vzorků obsahujících větší množství balastních látek, které by mohly vyvolat předčasné znehodnocení kolony, bývá často před vlastní kolonou zařazena ochranná předkolonka. Jako chemicky vázané stacionární nepolární skupiny pro reverzní fázi se nejčastěji používají C8H17–, C18H37– a méně často fenyl. Tyto skupiny jsou obvykle vázány na vrstvu silikagelu. Pro takto hydrofobizovanou stacionární fázi se používá spíše polárních mobilních fází na bázi binárních až ternárních směsí vody, methanolu, acetonitrilu, THF (tetrahydrofuran) či dioxanu. Retenční poměry řady látek se dají ovlivnit změnou pH mobilní fáze (např. zvýšením pH mobilní fáze se zvyšují retenční časy bazických látek a snižují retenční časy kyselých složek) (16, 20).

V analýze fenolových látek je téměř výhradně používána stacionární fáze C18 s vnitřním průměrem kolony od 2 do 5 mm (HPLC ve spojení s hmotnostní detekcí využívá menších průměrů). Velikost částic bývá většinou 3 až 5 μm. Nejčastěji se používá lineární gradientová eluce, mobilní fáze se skládá z polární a nepolární části, někdy obsahuje i roztoky s pufrační kapacitou. Vodná fáze obsahuje často přídavek kyseliny octové, používaná organická rozpouštědla v nepolární fázi jsou methanol, acetonitril, propanol, butanol, THF, ethylacetát a další. Volba mobilní fáze a její pH závisí na druhu použité stacionární fáze. Mobilní fáze obsahují často příměsi organických kyselin (nejčastěji kyselina octová) pro zvýšení retence slabě kyselých látek, případně příměsi slabých zásad pro zvýšení retence slabě zásaditých látek. Eluce bývá obvykle prováděna s binárním lineárním gradientem (1, 21).

HPLC s reverzní stacionární fází je používána především pro analýzu nepolárních a slabě polárních látek, je ale možné jí využít i k analýze silně kyselých, případně silně zásaditých látek. K těmto účelům se používá modifikací HPLC na reverzní fázi (RPLC), konkrétně IP-RPLC, kde retenci kyseliny (zásady) v reverzní fázi zvyšuje přítomnost protiiontu, odtud označení iontově párová – RPLC. Protiiontem pro kyselé látky bývá běžně např. octan amonný, pro zásady např. kyselina mravenčí. Jinou možností separace silně polárních látek jsou metody v provedení chromatografie na měničích iontů (IC-RPLC) (22,23).

Za obvyklých podmínek analýzy na reverzní fázi jsou nejvíce polární látky eluovány jako první, tedy diglykosidy předchází monoglykosidy a monoglykosidy předchází aglykony. Pro stejně substituované sloučeniny klesá intenzita afinity k mobilní fázi v pořadí flavanony > flavonoly > flavony. Chromatografické chování anthokyanů na koloně s reverzní fází je určeno celkovou polaritou a stereochemií sloučeniny. Klíčovými faktory jsou především charakter substituce B-kruhu flavanového skeletu, počet, poloha a druh sacharidických substituentů, případně míra jejich acylace. Tedy substituce B-kruhu určuje pořadí eluce jednotlivých látek jako delfinidin < kyanidin < petunidin < pelargonidin < peonidin < malvidin. Glykosylace celkově snižuje retenci v řadě 3,7-diglykosidy < 3,5-diglykosidy < 3-glykosidy a 3-galaktosidy < 3-glukosidy < 3-rutinosidy. Případná acetylace cukerných složek snižuje mobilitu sloučenin (21).

Dalluge a kol. (24) srovnával vhodnost šesti různých kolon a dvou mobilních fází pro analýzu čajových katechinů pomocí HPLC na reverzní fázi. Eluované látky byly detekovány spektrofotometricky při vlnové délce λ = 210 nm. Pro správné rozlišení látek za daných podmínek bylo nezbytné použít mobilní fáze (acetonitril-voda a acetonitril, methanol-voda) s přídavkem kyseliny trifluorooctové. Nejvyšší účinnosti dosahovaly deaktivované monomerní kolony s oktadecylsilylovou fází.

2.2.2.4 Detektory používané pro HPLC

Třemi základními variantami detekce pro kapalinovou chromatografii jsou:

  • A – optické detektory
  • B – hmotnostní detektor
  • C – elektrochemické detektory.
A Optické detektory

Dřívější detekce eluovaných látek byla založena především na sledování absorpce záření o charakteristické vlnové délce. Eluát zde obvykle protéká měrnou celou malého objemu s velkou optickou délkou, kde je při vhodné vlnové délce registrována absorbance eluátu. Zdrojem záření bývá obvykle deuteriová výbojka pro UV oblast a halogenová zářivka pro viditelnou oblast. Je možno výhodně využít nastavitelnosti jednokanálového snímače na různou vlnovou délku, případně použít mnohokanálové detekce. Pro skupinu anthokyanidinů a anthokyanů se jednalo o rozmezí 515–520 nm, ostatní flavonoidy byly detekovány v různých hodnotách UV-spektra, např. 280 nm pro flavanonové glykosidy. Většina flavonoidů vykazuje dvě hlavní skupiny absorpčních pásů: pás v rozmezí 320–385 nm vlivem absorpce B-kruhu a druhý pás v rozmezí 250–285 nm vlivem absorpce kruhu A (12, 27).

Značného rozšíření se dostalo detektoru s diodovým polem (diode-array detektor, DAD), který je schopen snímat spektra látek v širším vlnovém rozsahu a pro charakterizaci stanovovaných látek je tedy použito jak retenčního chování na koloně, tak jejich spektrálních vlastností. S narůstajícím počtem hydroxylových skupin molekuly dochází k posunu absorpčních maxim k viditelným oblastem světelného spektra (12).

Fluorimetrický detektor využívá funkce excitačního monochromátoru, který produkuje záření absorbované fluorescenčně aktivními látkami. Následné emitované záření je detekováno fotoelektrickým násobičem po průchodu emisním monochromátorem, lze tedy nezávisle měnit dva parametry: excitační i emisní vlnovou délku. Jednoznačnou předností fluorimetrického detektoru je jeho vysoká citlivost, v řadě případů je schopen detekovat eluovanou látku v koncentraci 10–1000x menší než fotometrický detektor. Použití fluorescenčního detektoru je ovšem omezeno pouze na látky, které vykazují přirozenou fluorescenci, nebo na nefluoreskující látky, které lze na fluoreskující sloučeniny převést vhodnou reakcí. Z fenolových látek jsou např. deriváty hydroxykumarinu, skopolin a umbelliferon schopny emitovat záření v rozmezí vlnové délky 450-460 nm.

B Hmotnostní detektor

Značné pozornosti si zasluhuje spojení HPLC s hmotnostním detektorem (MS), který je v podstatě univerzální a dovoluje přesnou identifikaci velkého množství látek. Nevýhodou hmotnostní spektrometrie jsou vysoké nároky na čistotu analytu, a dále potom velmi vysoké pořizovací a provozní náklady měřicí techniky. Nejčastějším způsobem ionizace bývá ionizace za atmosférického tlaku (API) ve dvou hlavních uspořádáních dle ionizačních zdrojů jako elektrospray (ESI) a chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI). Oba dva způsoby mohou vhodně sloužit k analýze širokého spektra látek. ESI patří mezi vysoce citlivé, šetrné ionizační techniky, je vhodná pro analýzu polárních, netěkavých, termolabilních sloučenin, jako jsou např. anthokyany. APCI je dalším zdokonalením electrospray ionizace, při kterém dochází k ionizaci odpařeného vzorku pomocí koronového výboje, analyzované látky získávají elektrický náboj chemickou ionizací. APCI byla použita např. pro stanovení isoflavonů (12, 19, 28, 29).

C Elektrochemická detekce

Pro analýzu polyfenolových látek je dále možno použít detekčních metod založených na měření elektrochemických reakcí. Rozlišení jednotlivých sloučenin je založeno na míře jejich oxidovatelnosti, která souvisí se změnami ve struktuře molekul jednotlivých polyfenolů, respektive s dostupností elektronů a schopností stabilizace náboje.

Dvěma nejběžnějšími možnostmi elektrochemické detekce v analýze polyfenolových látek jsou voltametrická a coulometrická detekce.

Voltametrický detektor: dovoluje zaznamenat velmi malé koncentrace organických látek v efluentu v těch případech, kdy jsou látky elektrochemicky redukovatelné nebo oxidovatelné. Princip detekce je založen na měření proudu mezi polarizovatelnou a měřenou elektrodou v závislosti na vloženém potenciálu. Často je tento detektor označován jako amperometrický detektor, neboť na elektrody se zpravidla vkládá konstantní potenciál a proud je měřen v závislosti na čase. Základní podmínkou voltametrického měření je dostatečná vodivost mobilní fáze (27).

Coulometrický detektor: při coulometrickém stanovení dochází ke kvantitativní oxidaci (případně redukci) analytu na pracovní elektrodě nebo kvantitativně reaguje s činidlem činidlem na elektrodě vzniklým. Elektroda bývá vyrobena z porézního grafitového materiálu. Při způsobu coulometrické analýzy za kontrolovaného potenciálu, kdy je na elektrochemickou celu vloženo konstantní napětí, je celkový náboj roven ploše pod křivkou závislosti proudu na čase. Látkové množství stanovovaného analytu se vypočte z Faradayova zákona. Proud probíhající celou je úměrný koncentraci redukovatelného (oxidovatelného) analytu a s probíhající reakcí klesá. Coulometrický detektor dosahuje vyšší selektivity a citlivosti vůči analytu (15, 25, 26, 27).

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

e-liquids, e-juices and nicotine liquids - Customized solutions for complete analysis

Brožury a specifikace
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Shimadzu Food Safety Management Data Book

Příručky
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC, GC/MSD, GC/SQ, HPLC, LC/MS, GPC, LC-SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Experience New Benchmarks with Empower Shimadzu’s LC/GC Drivers for Waters™ Empower™

Ostatní
| 2020 | Shimadzu
Instrumentace
Software
Výrobce
Shimadzu, Waters
Zaměření
---
 

Podobné články

Vědecký článek | Akademie

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

Článek se zabývá pokroky v kapalinové chromatografii. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívající principu separace na porézních částicích menších než 2 μm, byla využita při separaci a stanovení prostorových forem iso-α-hořkých látek v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Na reprezentativní skupině 11 vzorků chmele byla porovnána klasická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stále více rozšířenou ultra účinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC).
Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech
St, 30.9.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.

Pixabay/skeeze: Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech

Článek popisuje způsoby analytického stanovení polyfenolů v pivovarství. Metody pro toto stanovení jsou rozděleny do dvou skupin, analytické metody pro stanovení skupin polyfenolů a metody pro stanovení individuálních polyfenolů. Skupinové metody slouží ke stanovení anthokyanogenů, tanoidů a flavonoidů. Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.

1 ÚVOD

Polyfenoly jsou sekundární metabolity rostlin, které do piva přechází ze sladu a chmele. V průběhu pivovarského procesu dochází ke změnám jejich zastoupení a struktury a v řadě kroků ovlivňují technologický postup.

Mezi jejich nejdůležitější chemické vlastnosti patří schopnost reagovat s proteiny za tvorby výšemolekulárních komplexů a dále jejich antioxidační aktivita. Tvorba polyfenolbílkovinných komplexů negativně ovlivňuje koloidní stabilitu piva, zatímco redukční schopnost a schopnost vychytávání volných radikálů působí pozitivně na senzorickou stabilitu piva i na lidské zdraví.

Polyfenoly jakožto přirozené antioxidanty vyskytující se v potravě mohou snižovat pravděpodobnost výskytu některých civilizačních chorob konzumentů, v této souvislosti se uplatňují především antiaterosklerotické, antikarcinogenní, případně fytoestrogenní účinky některých polyfenolových látek.

Z uvedených důvodů jsou analytické metody stanovení polyfenolů předmětem výzkumu nejen pivovarských analytiků. Ačkoliv v minulosti se používala celá řada různorodých způsobů stanovení těchto látek, dnes analýze dominuje především vysokoúčinná kapalinová chromatografie se spektrofotometrickou, hmotnostní nebo elektrochemickou detekcí. Aktuálním problémem stanovení je izolace, přečištění a zakoncentrování analyzovaných látek z vysoce komplexní přírodní matrice.

2 ANALYTICKÉ METODY PRO STANOVENÍ POLYFENOLŮ

Metody používané v analýze polyfenolových látek je možno v současné době rozdělit do dvou hlavních částí. První z nich využívá společných vlastností větších či menších skupin polyfenolových sloučenin a jedná se tedy o metody skupinové.

Analytickým metodám pro stanovení jednotlivých polyfenolových látek dominuje HPLC (High Performance Liquid Chromatography – vysokoúčinná kapalinová chromatografie) na reverzní fázi s různými možnostmi detekce UV-VIS, DAD (detektor s diodovým polem), MS (hmotnostní detektor). Staršími možnostmi jsou kapilární plynová chromatografie (CGC), papírová chromatografie (PC), chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a podobně (1).

2.1 Skupinové analytické metody
Stanovení celkových polyfenolů metodou EBC:

Tato metoda je založena na reakci polyfenolů s trojmocnými ionty železa v alkalickém prostředí, při které dochází k tvorbě červeně zbarveného komplexu. Intenzita vzniklého zbarvení je měřena spektrofotometricky při vlnové délce λ = 600 nm proti slepému pokusu. Výsledek je dán vzorcem a uvádí se v miligramech na litr (2).

Stanovení anthokyanogenů podle Harrise a Ricketse:

V této metodě jsou polyfenolové látky vzorku nejprve adsorbovány polyamidovým práškem, zachycené látky jsou potom z adsorbentu uvolněny za tepla působením směsi butanol-chlorovodíkové kyseliny. Intenzita zbarvení vzniklých oxoniových solí je určena spektrofotometricky při λ = 550 nm proti slepému pokusu. Závislost obsahu anthokyanogenů na naměřené absorbanci je tabelována a výsledky je možno odečíst z tabulky (3).

Stanovení tanoidů podle Chapona:

Metoda je založena na principu tvorby komplexů polyfenolů s polyvinylpyrrolidonem (PVP).Do roztoku obsahujícího tanoidy se dávkuje polyvinylpyrrolidon (PVP). Vzniká zákal, jehož intenzita se zvyšuje tak dlouho, než se všechny tanoidy adsorbují. Množství PVP, které se musí přidat k dosažení maxima zákalu, je proporcionální obsahu tanoidů. Vzniklý zákal se změří nefelometricky. Výsledek je dán vzorcem a je vyjádřen v miligramech PVP na litr (3).

Stanovení flavanoidů:

V kyselém prostředí reagují flavanoidy s chromogenem pdimethylaminocinnamaldehydem za vzniku barevných pigmentů. Metoda dovoluje kvantitativní stanovení např. katechinu a proanthokyanidinu. Vzorek se smíchá s kyselou solucí chromogenu a výsledná intenzita zbarvení je proměřena spektrofotometricky při vlnové délce λ = 640 nm. Výsledek je dán vzorcem a je vyjádřen v katechinových ekvivalentech v miligramech na litr (2).

2.2 Analytické metody pro stanovení jednotlivých polyfenolů

Volby jednotlivých analytických kroků pro stanovení jednotlivých polyfenolů jsou shrnuty v následující části. Extrakce a zakoncentrování stanovovaných látek bývá běžně provedeno v jednom kroku, dále se někdy zavádí frakcionace polyfenolů na fenolové kyseliny a neutrální látky.

2.2.1 Extrakce, zakoncentrování a purifikace

Nízká hladina polyfenolových látek v analyzovaném materiálu často vyžaduje provedení vhodné extrakce vedoucí k získání zakoncentrovaného podílu analyzovaných látek s redukovaným obsahem interferujících příměsí. Vzhledem ke značné složitosti chromatogramů extraktů polyfenolů z HPLC, zavádí někteří autoři analytické kroky vedoucí k frakcionaci polyfenolových látek nejčastěji na základě rozdílné disociační konstanty (4,5).

Z hlediska provedení se dají jednotlivé metody extrakce rozdělit do dvou následujících skupin: LLE (Liquid-liquid extraction – extrakce kapalina-kapalina) a SPE (Solid Phase Extraction – extrakce na pevné fázi). Např. Bendini a kol. 6 se zabývali porovnáním výtěžností extrahovaných látek z olivového oleje pomocí SPE a LLE. Pirisi a kol. (7) se také zabývají srovnáním SPE s C18 a C8 náplní a LLE s hexanem. Kvantifikace zachycených sloučenin byla provedena pomocí HPLC-DAD-MS a CZE (kapilární zónová elektroforéza) s UV-VIS detekcí. Pořadí jednotlivých metod dle klesající výtěžnosti bylo LLE, C18 a C8-SPE.

Extrakční a čisticí kroky obecně prodlužují dobu analýzy, Cappanesi a kol. 8 uvádí alternativní možnost detekce pomocí biosenzoru, založené na tyrosinasové oxidaci polyfenolových sloučenin, která nevyžaduje předcházející úpravu vzorku.

2.2.1.1 Kapalinová extrakce – (LLE – Liquid-liquid extraction)

V potravinářské analýze polyfenolových látek existuje velká variabilita různých analyzovaných materiálů, přesto se pro účely kapalinové extrakce používá relativně malé množství extrakčních činidel, a to buď samotných, nebo ve vzájemné kombinaci.

Tradičními běžně používanými rozpouštědly jsou horká voda, methanol, ethanol, aceton, a ethylacetát, který se vyskytuje nejčastěji. Vzácněji jsou používána jiná rozpouštědla, např. acetonitril, DMF (dimethylformamid) a chloroform (5, 9).

Extrakce je z důvodu dosažení maximálního výtěžku často prováděna za nepřístupu světla, kyslíku, s přídavkem umělých antioxidantů apod. Mechanická úprava vzorku bývá použita k zamezení molekulárních interakcí, respektive k podpoře uvolnění látek z vázaných forem. Nejčastějším provedením extrakce fenolových kyselin bývá opakovaná Soxhlethova extrakce trvající v jednom kroku jednu až šest hodin (1).

Extrakce flavonoidů a jednoduchých fenolových kyselin probíhá obdobně, rozdělovacím faktorem je pH, čehož lze využít pro oddělení těchto dvou frakcí. Frakcionaci je tedy možné provést např. kapalinovou extrakcí ethylacetátem při pH 7 a při pH 2, případně zádrží na C18 koloně a elucí roztoky o různém pH. Jinou možností rozdělení polyfenolů na fenolové kyseliny a neutrální látky může být frakcionace pomocí iontovýměnné chromatografie na silném anexu (1, 10).

Z jiných možností např. Chang a kol. (11) uvádí možnost použití nadkritické fluidní extrakce oxidem uhličitým pro izolaci polyfenolových látek zeleného čaje.

2.2.1.2 Extrakce na pevné fázi – (SPE)

K tomuto druhu extrakce se nejčastěji používá chromatografických náplňových kolon s řadou adsorpčních materiálů, jako jsou polyamidové materiály, PVPP, Sephadex, modifikovaný silikagel, mikrokrystalická celulosa a další. S extrakčním krokem analýzy zde bývá často spojeno i přečištění analytu, případně frakcionace jednotlivých skupin polyfenolových látek. Silikagel je zvláště vhodný pro analýzu méně polárních isoflavonů, flavanonů, flavonů a flavonolových glykosidů. K modifikaci vnitřního povrchu silikagelové náplně kolon se používají obdobné funkční skupiny jako v případě kolon pro HPLC na reverzní fázi (C8, C18, DIOL). Naproti tomu polyamid je adsorbent vhodný pro separaci flavonoidů o různé polaritě, zvláště pak glykosidů (12). Minikolonky s náplní polyamidu 6 byly použity k frakcionaci flavonolů z červené malinové šťávy. První část flavonoidů, která byla získaná elucí methanolem, obsahovala glykosidy kvercetinu, kvercetin a kempferol. Druhá část byla z kolony vymyta mobilní fází skládající se z 0,5% roztoku amoniaku v methanolu a obsahovala flavonolové glukuronidy, aglykony, kyselinu ellagovou a její deriváty (13).

Např. Mc Murrough a kol. (14) uvádějí extrakci směsí aceton/voda, odpaření rozpouštědla, rozpuštění zbytku v ethanolu a následnou frakcionaci polyfenolů na koloně s náplní Sephadex.

García a kol. (5) uvádí metodu zakoncentrování na C18 Sep-Pak koloně kondicionované methanolem a promyté vodou. Po nanesení a eluci okyseleného vzorku byla kolona vysušena dusíkem. Zachycené fenolové látky byly eluovány acetonitrilem a po odpaření rozpouštědla na vakuové odparce opět rozpuštěny ve směsi methanol/voda (1:1) s 1 % kyseliny sírové. Oddělení flavanových glykosidů od flavonolů nebo flavonových glykosidů je obvykle obtížné, ale může být provedeno na celulosových kolonách s vodou jako promývacím roztokem (15).

2.2.2 Chromatografické metody a detekce látek

Mezi starší metody analýzy polyfenolů v potravinách patří jednoduchá provedení chromatografických metod. Do této skupiny patří např. papírová chromatografie (PC), používající jako stacionární fázi chromatografický papír.

Z dalších dříve značně využívaných metod je možno zmínit např. chromatografii na tenké vrstvě (TLC) s různými možnostmi stacionární fáze (silikagel, celulosa, polyamid). Výběr pevné fáze závisí na skupině flavonoidů, která má býti analyzována, hydrofilní flavonoidy mohou být snadno separovány pomocí TLC na polyamidu nebo mikrokrystalické celulose. Silikagel bývá používán při TLC analýze méně hydrofilních látek jako jsou flavony a isoflavony. Detekce separovaných skupin analytů je prováděna reakcí s činidly za tvorby barevných komplexů, případně tvorby fluoreskujících komplexů. Chromatografie na tenké vrstvě je finančně a časově nenáročná, její hlavní nevýhodou je omezená možnost kvantifikace a nízká výtěžnost (1, 13, 17).

2.2.2.1 Kapilární zónová elektroforéza – (CZE)

CZE je vysoce účinná metoda, při které dochází k separaci látek na krátké křemenné kapiláře s průměrem od 50–100 μm. Jedná se o poměrně rychlou a levnou metodu, která může dosáhnout lepší selektivity než analýza pomocí HPLC (9). Separaci kromě parametrů kapiláry ovlivňuje navíc pH a také organické látky, které se používají jako modifikátory v nosných elektrolytech. Tato rozpouštědla ovlivňují pohyblivost analytu snížením polarity pufru, mohou zlepšit selektivitu a tím zvýšit pravděpodobnost identifikace analyzovaných látek (18). CZE umožňuje paralelní stanovení široké škály nabitých látek, zatímco sloučeniny bez náboje jsou odnášeny elektroosmotickým tokem bez separace. Molekuly flavonoidů obsahují elektrický náboj v alkalickém prostředí. Aby nedošlo k zahlcení kapiláry, bývá objem analyzovaného vzorku velmi nízký (13).

Na rozhraní mezi elektroforetickými a chromatografickými metodami se pohybuje micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC).

2.2.2.2 Plynová chromatografie – (GC)

Základním problémem použití této analytické metody je nízká těkavost fenolových sloučenin. Z tohoto důvodu se její využití omezuje především na stanovení jednoduchých fenolových kyselin a nízkomolekulárních flavonoidů. Hydroxylové skupiny je nutno převést na ethery, případně estery. K derivatizaci bývá nejčastěji použita trialkylsilylová skupina, nejčastěji v podobě trimethylsilylových derivátů. Nejběžněji používanými silylačními činidly pro derivatizaci fenolových kyselin jsou N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamid, N-metyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid a N,O-bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid. Pro vlastní chromatografické rozdělení jsou nejčastěji použity kapilární kolony z taveného křemene o délce 25–30 m, vnitřním průměru 0,25–0,5 mm a tloušťce vnitřní vrstvy (stacionární fáze) 0,25 μm. Jako příklad používané stacionární fáze je možno uvést polysiloxanový materiál DB-5, který obsahuje 95 % methylových a 5% fenylových substituentů.

K detekci byl dříve běžně používán plamenově ionizační detektor (FID), dnes převládá spojení plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) v uspořádání s ionizací nárazem elektronu (EI) (1, 19).

2.2.2.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – (HPLC)

Nejpoužívanější současnou metodou pro stanovení polyfenolových látek je vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi.

Kolony používané v HPLC analýze bývají 10–100 cm dlouhé (nejčastěji 10–25 cm), jejich vnitřní průměr se obvykle pohybuje v rozmezí od 0,2 do 5 mm. U přírodních vzorků obsahujících větší množství balastních látek, které by mohly vyvolat předčasné znehodnocení kolony, bývá často před vlastní kolonou zařazena ochranná předkolonka. Jako chemicky vázané stacionární nepolární skupiny pro reverzní fázi se nejčastěji používají C8H17–, C18H37– a méně často fenyl. Tyto skupiny jsou obvykle vázány na vrstvu silikagelu. Pro takto hydrofobizovanou stacionární fázi se používá spíše polárních mobilních fází na bázi binárních až ternárních směsí vody, methanolu, acetonitrilu, THF (tetrahydrofuran) či dioxanu. Retenční poměry řady látek se dají ovlivnit změnou pH mobilní fáze (např. zvýšením pH mobilní fáze se zvyšují retenční časy bazických látek a snižují retenční časy kyselých složek) (16, 20).

V analýze fenolových látek je téměř výhradně používána stacionární fáze C18 s vnitřním průměrem kolony od 2 do 5 mm (HPLC ve spojení s hmotnostní detekcí využívá menších průměrů). Velikost částic bývá většinou 3 až 5 μm. Nejčastěji se používá lineární gradientová eluce, mobilní fáze se skládá z polární a nepolární části, někdy obsahuje i roztoky s pufrační kapacitou. Vodná fáze obsahuje často přídavek kyseliny octové, používaná organická rozpouštědla v nepolární fázi jsou methanol, acetonitril, propanol, butanol, THF, ethylacetát a další. Volba mobilní fáze a její pH závisí na druhu použité stacionární fáze. Mobilní fáze obsahují často příměsi organických kyselin (nejčastěji kyselina octová) pro zvýšení retence slabě kyselých látek, případně příměsi slabých zásad pro zvýšení retence slabě zásaditých látek. Eluce bývá obvykle prováděna s binárním lineárním gradientem (1, 21).

HPLC s reverzní stacionární fází je používána především pro analýzu nepolárních a slabě polárních látek, je ale možné jí využít i k analýze silně kyselých, případně silně zásaditých látek. K těmto účelům se používá modifikací HPLC na reverzní fázi (RPLC), konkrétně IP-RPLC, kde retenci kyseliny (zásady) v reverzní fázi zvyšuje přítomnost protiiontu, odtud označení iontově párová – RPLC. Protiiontem pro kyselé látky bývá běžně např. octan amonný, pro zásady např. kyselina mravenčí. Jinou možností separace silně polárních látek jsou metody v provedení chromatografie na měničích iontů (IC-RPLC) (22,23).

Za obvyklých podmínek analýzy na reverzní fázi jsou nejvíce polární látky eluovány jako první, tedy diglykosidy předchází monoglykosidy a monoglykosidy předchází aglykony. Pro stejně substituované sloučeniny klesá intenzita afinity k mobilní fázi v pořadí flavanony > flavonoly > flavony. Chromatografické chování anthokyanů na koloně s reverzní fází je určeno celkovou polaritou a stereochemií sloučeniny. Klíčovými faktory jsou především charakter substituce B-kruhu flavanového skeletu, počet, poloha a druh sacharidických substituentů, případně míra jejich acylace. Tedy substituce B-kruhu určuje pořadí eluce jednotlivých látek jako delfinidin < kyanidin < petunidin < pelargonidin < peonidin < malvidin. Glykosylace celkově snižuje retenci v řadě 3,7-diglykosidy < 3,5-diglykosidy < 3-glykosidy a 3-galaktosidy < 3-glukosidy < 3-rutinosidy. Případná acetylace cukerných složek snižuje mobilitu sloučenin (21).

Dalluge a kol. (24) srovnával vhodnost šesti různých kolon a dvou mobilních fází pro analýzu čajových katechinů pomocí HPLC na reverzní fázi. Eluované látky byly detekovány spektrofotometricky při vlnové délce λ = 210 nm. Pro správné rozlišení látek za daných podmínek bylo nezbytné použít mobilní fáze (acetonitril-voda a acetonitril, methanol-voda) s přídavkem kyseliny trifluorooctové. Nejvyšší účinnosti dosahovaly deaktivované monomerní kolony s oktadecylsilylovou fází.

2.2.2.4 Detektory používané pro HPLC

Třemi základními variantami detekce pro kapalinovou chromatografii jsou:

  • A – optické detektory
  • B – hmotnostní detektor
  • C – elektrochemické detektory.
A Optické detektory

Dřívější detekce eluovaných látek byla založena především na sledování absorpce záření o charakteristické vlnové délce. Eluát zde obvykle protéká měrnou celou malého objemu s velkou optickou délkou, kde je při vhodné vlnové délce registrována absorbance eluátu. Zdrojem záření bývá obvykle deuteriová výbojka pro UV oblast a halogenová zářivka pro viditelnou oblast. Je možno výhodně využít nastavitelnosti jednokanálového snímače na různou vlnovou délku, případně použít mnohokanálové detekce. Pro skupinu anthokyanidinů a anthokyanů se jednalo o rozmezí 515–520 nm, ostatní flavonoidy byly detekovány v různých hodnotách UV-spektra, např. 280 nm pro flavanonové glykosidy. Většina flavonoidů vykazuje dvě hlavní skupiny absorpčních pásů: pás v rozmezí 320–385 nm vlivem absorpce B-kruhu a druhý pás v rozmezí 250–285 nm vlivem absorpce kruhu A (12, 27).

Značného rozšíření se dostalo detektoru s diodovým polem (diode-array detektor, DAD), který je schopen snímat spektra látek v širším vlnovém rozsahu a pro charakterizaci stanovovaných látek je tedy použito jak retenčního chování na koloně, tak jejich spektrálních vlastností. S narůstajícím počtem hydroxylových skupin molekuly dochází k posunu absorpčních maxim k viditelným oblastem světelného spektra (12).

Fluorimetrický detektor využívá funkce excitačního monochromátoru, který produkuje záření absorbované fluorescenčně aktivními látkami. Následné emitované záření je detekováno fotoelektrickým násobičem po průchodu emisním monochromátorem, lze tedy nezávisle měnit dva parametry: excitační i emisní vlnovou délku. Jednoznačnou předností fluorimetrického detektoru je jeho vysoká citlivost, v řadě případů je schopen detekovat eluovanou látku v koncentraci 10–1000x menší než fotometrický detektor. Použití fluorescenčního detektoru je ovšem omezeno pouze na látky, které vykazují přirozenou fluorescenci, nebo na nefluoreskující látky, které lze na fluoreskující sloučeniny převést vhodnou reakcí. Z fenolových látek jsou např. deriváty hydroxykumarinu, skopolin a umbelliferon schopny emitovat záření v rozmezí vlnové délky 450-460 nm.

B Hmotnostní detektor

Značné pozornosti si zasluhuje spojení HPLC s hmotnostním detektorem (MS), který je v podstatě univerzální a dovoluje přesnou identifikaci velkého množství látek. Nevýhodou hmotnostní spektrometrie jsou vysoké nároky na čistotu analytu, a dále potom velmi vysoké pořizovací a provozní náklady měřicí techniky. Nejčastějším způsobem ionizace bývá ionizace za atmosférického tlaku (API) ve dvou hlavních uspořádáních dle ionizačních zdrojů jako elektrospray (ESI) a chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI). Oba dva způsoby mohou vhodně sloužit k analýze širokého spektra látek. ESI patří mezi vysoce citlivé, šetrné ionizační techniky, je vhodná pro analýzu polárních, netěkavých, termolabilních sloučenin, jako jsou např. anthokyany. APCI je dalším zdokonalením electrospray ionizace, při kterém dochází k ionizaci odpařeného vzorku pomocí koronového výboje, analyzované látky získávají elektrický náboj chemickou ionizací. APCI byla použita např. pro stanovení isoflavonů (12, 19, 28, 29).

C Elektrochemická detekce

Pro analýzu polyfenolových látek je dále možno použít detekčních metod založených na měření elektrochemických reakcí. Rozlišení jednotlivých sloučenin je založeno na míře jejich oxidovatelnosti, která souvisí se změnami ve struktuře molekul jednotlivých polyfenolů, respektive s dostupností elektronů a schopností stabilizace náboje.

Dvěma nejběžnějšími možnostmi elektrochemické detekce v analýze polyfenolových látek jsou voltametrická a coulometrická detekce.

Voltametrický detektor: dovoluje zaznamenat velmi malé koncentrace organických látek v efluentu v těch případech, kdy jsou látky elektrochemicky redukovatelné nebo oxidovatelné. Princip detekce je založen na měření proudu mezi polarizovatelnou a měřenou elektrodou v závislosti na vloženém potenciálu. Často je tento detektor označován jako amperometrický detektor, neboť na elektrody se zpravidla vkládá konstantní potenciál a proud je měřen v závislosti na čase. Základní podmínkou voltametrického měření je dostatečná vodivost mobilní fáze (27).

Coulometrický detektor: při coulometrickém stanovení dochází ke kvantitativní oxidaci (případně redukci) analytu na pracovní elektrodě nebo kvantitativně reaguje s činidlem činidlem na elektrodě vzniklým. Elektroda bývá vyrobena z porézního grafitového materiálu. Při způsobu coulometrické analýzy za kontrolovaného potenciálu, kdy je na elektrochemickou celu vloženo konstantní napětí, je celkový náboj roven ploše pod křivkou závislosti proudu na čase. Látkové množství stanovovaného analytu se vypočte z Faradayova zákona. Proud probíhající celou je úměrný koncentraci redukovatelného (oxidovatelného) analytu a s probíhající reakcí klesá. Coulometrický detektor dosahuje vyšší selektivity a citlivosti vůči analytu (15, 25, 26, 27).

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

e-liquids, e-juices and nicotine liquids - Customized solutions for complete analysis

Brožury a specifikace
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Shimadzu Food Safety Management Data Book

Příručky
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC, GC/MSD, GC/SQ, HPLC, LC/MS, GPC, LC-SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Experience New Benchmarks with Empower Shimadzu’s LC/GC Drivers for Waters™ Empower™

Ostatní
| 2020 | Shimadzu
Instrumentace
Software
Výrobce
Shimadzu, Waters
Zaměření
---
 

Podobné články

Vědecký článek | Akademie

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

Článek se zabývá pokroky v kapalinové chromatografii. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívající principu separace na porézních částicích menších než 2 μm, byla využita při separaci a stanovení prostorových forem iso-α-hořkých látek v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Na reprezentativní skupině 11 vzorků chmele byla porovnána klasická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stále více rozšířenou ultra účinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC).
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.