Organická analýza - kapalinová chromatografie (LC) 1/4

5 KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC)

5.1 Princip kapalinové chromatografie

5.2 Nízko- a vysokotlaké techniky, analytická a preparativní LC

5.3 Termodynamický a kinetický aspekt chromatografie, chromatografická data

5.4 Kolony v HPLC

• 5.4.1 Tok mobilní fáze kolonou, náplně kolon pro HPLC - pórovité, povrchově pórovité, monolitické
• 5.4.2 Stacionární fáze

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Princip kapalinové chromatografie

Chromatografická separace probíhá v chromatografickém loži (kolona, papír, tenká vrstva), což je systém dvou fází, z nichž jedna je v klidu (fáze stacionární) a druhá se vůči ní pohybuje (fáze mobilní), spolu se složkami vzorku. Podle geometrie chromatografického lože rozeznáváme sloupcovou (kolonovou) kapalinovou a plynovou chromatografii a kapalinovou chromatografii v plošném uspořádání (planární) - na papíru nebo na tenké vrstvě adsorbentu.

Ideální chromatografický proces lze charakterizovat rovnovážným rozdělením složek vzorku mezi stacionární a mobilní fází v jakémkoliv čase a na jakémkoliv místě v chromatografickém loži. Tato rovnováha se neustále porušuje a okamžitě opět obnovuje, jak čerstvá mobilní fáze přichází do styku se vzorkem zadržovaným ve stacionární fázi.

Obr. 5.1 znázorňuje postup separace dvou látek při průchodu chromatografickým ložem.

• Na obr. 5.1a je stav při zavedení vzorku do chromatografického lože.
• Obr. 5.1b ukazuje začátek separace, kdy se látka s větší afinitou ke stacionární fázi (trojúhelníčky) na ní silněji zadržuje.
• Na obr. 5.1c se postupně oddělují zóny s jednotlivými složkami vzorku, které se pohybují chromatografickým ložem, každá vlastní rychlostí, ui, menší, než je postupná rychlost toku mobilní fáze, u. Méně zadržované látky (znázorněné kroužky) procházejí chromatografickým ložem rychleji než látky s větší afinitou ke stacionární fázi (trojúhelníčky) které se více zadržují.
• Obr. 5.1d ukazuje stav po mnohonásobné opakované sorpci a zpětném uvolnění látek do mobilní fáze, kdy se složky vzorku úplně rozdělí.

2 THETA: Obr. 5.1 Schéma separace vzorku při průchodu chromatografickým ložem..jpg

Základem chromatografické separace jsou tedy rozdíly v afinitě složek vzorku ke stacionární fázi, které lze popsat distribuční konstantou, KD. Po ukončení separace se buď vyhodnotí vzájemná poloha zón vzorku v chromatografickém loži dosažená v předem určeném čase (prostorové rozlišení při chromatografii na papíru nebo na tenké vrstvě), nebo se měří čas, kdy jednotlivé zóny dosáhnou konce chromatografického lože (časové rozlišení na separační koloně).

Hlavním rozlišovacím kritériem chromatografických metod je skupenství mobilní fáze - u plynové chromatografie (gas chromatography, GC) je to nosný plyn, kapalinová chromatografie (liquid chromatography, LC) používá kapalnou mobilní fázi, zatímco stacionární fáze je zpravidla tuhá. Kapalné stacionární fáze zakotvené na nosiči nejsou dostatečně stabilní a v současné kapalinové chromatografii se nepoužívají. Výjimkou jsou dynamicky generované stacionární fáze, které se tvoří při ustavování rovnováhy mezi vícesložkovou mobilní fází a kapalnou vrstvou odlišného složení sorbovanou na povrchu adsorbentu (např. při HILIC chromatografii).

Na rozdíl od plynové chromatografie vzorky pro kapalinovou chromatografii nemusí být tepelně stálé a mít velkou tenzi par. Kapalinová chromatografie umožňuje pestřejší volbu separačních systémů s různými kombinacemi stacionárních a mobilních fází a dá se téměř univerzálně použít pro separace nejrůznějších typů látek, včetně silně polárních nebo i iontových a vysokomolekulárních přírodních či syntetických polymerů, při klinických a biochemických analýzách, analýzách léčiv a metabolitů, životního prostředí soudních analýzách a v mnoha dalších oblastech [1].

Nízko- a vysokotlaké techniky, analytická a preparativní LC

Při klasické sloupcové kapalinové chromatografii se používají skleněné kolony válcového tvaru, na dně opatřené fritou a kohoutem, plněné za sucha sorbenty s částicemi > 20 μm. Mobilní fáze (eluent) většinou protéká kolonou vlivem hydraulické síly z dělící nálevky. Eluent se separovanými složkami vzorku se postupně odebírá ve frakcích na výstupu z kolony pro další analýzu chemickou nebo instrumentální (zpravidla fotometrickou) metodou.

2 THETA: Obr. Skleněná kolona s nálevkou, fritou a výstupním kohoutem pro nízkotlakou LC

Moderní analytická vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) pracuje v kontinuálním uspořádání, téměř výhradně eluční technikou, kde čerpadlo dávkuje mobilní fázi při stálém průtoku kolonou, 2 - 30 cm dlouhou, s vnitřním průměrem 0,1 - 6 mm, plněnou sorbentem s jemnými částicemi s úzkou distribucí velikostí (se středním průměrem 2,5 - 10 μm), na nichž se dosahuje vysoké účinnosti (až 100 000 teoretických pater/m).

2 THETA: Obr. Schéma kapalinového chromatografu. 1 - zásobník mobilní fáze, 2 - vysokotlaké čerpadlo, 3 - průtočný odplyňovač mobilní fáze, 4 - separační kolona, 5 - detektor, 6 - termostat kolony, 7 - dávkovač vzorků (autosampler), 8 - počítač s chromatographickou datovou stanicí

Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (Ultra-High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) a ultraúčinná kapalinová chromatografie (Ultra-Performance Liquid Chromatography, UPLC) používá náplně kolon s částicemi menšími než 2 μm při velmi vysokém pracovním tlaku až 100-150 MPa (1000 - 1500 bar) [3]. Podobně u chromatografie na tenké vrstvě rozeznáváme klasickou TLC (Thin Layer Chromatography) a vysokoúčinnou techniku, HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) či přetlakovanou techniku, OPTLC (Overpressurized Thin Layer Chromatography).

Termodynamický a kinetický aspekt chromatografie, chromatografická data

Chromatografická separace je založena na rozdílech v distribuci jednotlivých složek vzorku mezi stacionární a mobilní fází. Při sloupcové chromatografii složky vzorku vystupují z kolony v různém čase. Chromatogram představuje časový záznam signálu detektoru se vzájemně oddělenými elučními vlnami (píky) jednotlivých látek. Při malém zatížení kolony vzorkem při lineární chromatografii mají píky (téměř) symetrický Gaussovský profil.

2 THETA: Obr. Ideální chromatogram dvousložkové směsi.jpg

Složky vzorku lze identifikovat na základě shody jejich elučních (retenčních) časů s retenčními časy standardů. Z výšek nebo ploch píků je možno stanovit obsah složek ve vzorku.

Kolony v HPLC

Dobrá chromatografická kolona musí být chemicky odolná vůči mobilní fázi a pracovnímu tlaku. Kolony pro HPLC obsahují chromatografické lože ve formě částic sorbentu nebo nosiče se stacionární fází v rovných bezešvých trubicích s leštěným vnitřním povrchem, z nerezové oceli, titanu, případně z pevného plastu (např. PEEK), nebo z tvrzeného skla (pro separace biopolymerů, kde je třeba zabránit katalytickým účinkům i stop kovů v mobilní fázi). Účinné a stabilní kolony pro HPLC se připravují plněním suspenzí částic náplně v kapalině s vysokou viskozitou nebo hustotou za vysokého tlaku, aby se zabránilo zhoršení účinnosti vlivem shlukování a sedimentace částic.

Kolony se dodávají buď s pevným koncovým šroubením, nebo jako výměnné kartridže pro upevnění v držácích s koncovkami pro opakované použití. Jsou na koncích opatřené fritami s póry 0,5 - 2 μm. Spodní frita zadržuje částice náplně, horní frita napomáhá pravidelnému rozdělení vzorku v průřezu kolony. Spojovací kapiláry mezi dávkovačem vzorku, kolonou a detektorem by měly být co nejkratší a měly by mít co nejmenší vnitřní průměr, aby se omezily mimokolonové příspěvky k rozšiřování píků.

Tok mobilní fáze kolonou, náplně kolon pro HPLC - pórovité, povrchově pórovité, monolitické

Částice náplní kolon pro HPLC musí být mechanicky i chemicky stabilní, odolávat používaným pracovním tlakům a mobilním fázím v co nejširším rozsahu teplot, měly by vykazovat vysokou chromatografickou účinnost (nízký výškový ekvivalent teoretického patra, H) a klást malý odpor toku mobilní fáze (mít dobrou permeabilitu, KF, která je přímo úměrná druhé mocnině střední velikosti částic náplně, d²p). Moderní částice náplní pro HPLC mají kulový tvar a jsou pečlivě tříděny na frakce s velmi úzkou distribucí velikosti částic.

Pórovitost materiálů pro HPLC kolony závisí na velikosti molekul separovaných látek. Pro separace běžných organických látek jsou vhodné částice s velikostí pórů 5 - 10 nm a specifickým povrchem 150 - 500 m²/g, zatímco pro separace polymerů se používají částice se širokými póry, 15 - 100 nm, a menším specifickým povrchem, zpravidla 10 - 150 m²/g. Ve větším objemu pórů mají makromolekuly snadnější přístup ke stacionární fázi uvnitř pórů vlivem menšího odporu proti převodu hmoty, čímž se zlepšuje účinnost separace. Pro velmi rychlé dělení biopolymerů byly vyvinuty náplně s nepórovitými sférickými částicemi o průměru 1,5 - 2,5 μm.

Podobné vlastnosti, ale mnohem menší odpor proti toku mobilní fáze mají kolony plněné povrchově pórovitými sférickými částicemi (2,6, nověji i 5 nebo < 2μm) s inertním pevným jádrem (core-shell), na němž je tenká vrstva pórovité aktivní stacionární fáze o tloušťce 0,5 m nebo i méně. Podstatně kratší dráha k povrchu stacionární fáze než u pórovitých náplní kolon možňuje dosažení rychlých a účinných separací, téměř srovnatelných s technikou UHPLC, ale na běžných přístrojích pro konvenční HPLC [10].

Stacionární fáze

Pro přípravu stacionárních fází pro HPLC se v současné době nejčastěji používá vysoce čistý silikagel typu sol-gel, mechanicky velmi stabilní, prakticky bez stopových příměsí kovů, které mohou nežádoucím způsobem katalyticky působit na složky vzorku.

Na povrchu silikagelu je rozmístěno cca 8-9 μmol/m² polárních hydroxylových skupin (silanoly, Si-OH), jejichž hustota roste úměrně se specifickým povrchem. Nemodifikovaný silikagel lze použít jako polární adsorbent v systémech s normálními fázemi, buď v čistě organických mobilních fázích (adsorpční chromatografie), nebo v polárních organických rozpouštědlech s menším obsahem vody (chromatografie hydrofilních interakcí, HILIC). Častěji silikagel slouží jako nosič chemicky vázaných nepolárních, polárních nebo i iontových stacionárních fází, které se naváží na jeho povrch, většinou prostřednictvím kovalentní Si–O–Si–C– vazby reakcemi se silanizačními činidly, např. s alkyldimethylchlorsilany [13] (Obr. 5.8). Dynamické vlastnosti těchto náplní (účinnost a permeabilita kolony) jsou určovány především vlastnostmi nosiče (silikagelu), tedy jeho strukturou a velikostí částic, zatímco termodynamické chování (retence a selektivita chromatografovaných látek) jsou dány chemicky vázanou fází [14].