Organická analýza - Gelová elektroforéza (GE)

8.3 Gelová elektroforéza

• 8.3.1 Úvod
• 8.3.2 Princip GE
• 8.3.3 Instrumentace
• 8.3.4 Typy gelů
  • 8.3.4.1 Agarosový gel
  • 8.3.4.2 Polyakrylamidový gel (PAGE)
  • 8.3.4.3 Další typy gelů
• 8.3.5 Separační elektrolyt
• 8.3.6 Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE)
• 8.3.7 Detekce
• 8.3.8 Blotting
• 8.3.9 Dvoudimenzionální (2D) gelová elektroforéza
• 8.3.10 Kapilární gelová elektroforéza (CGE)
  • 8.3.10.1 DNA sekvenování pomocí kapilární gelové elektroforézy
• 8.3.11 Závěr

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Úvod

Gelová elektroforéza (GE) patří k nejpoužívanějším separačním technikám v analýze nukleových kyselin a proteinů [1], ale také jiných polymerních materiálů například lipoproteinů [2] a sacharidů [3]. Je využívána především pro analýzu biologických vzorků, ale nachází uplatnění také v jiných oborech, např. je vhodná pro analýzu DNA pro kriminalistické účely nebo analýzu rostlinných materiálů. GE řadíme mezi plošné elektroforetické techniky, obdobně jako papírovou elektroforézu, protože se provádí na tenké vrstvě obsahující gelovou matrici. GE patří mezi jednu z nejúčinnějších metod pro separaci makromolekul a pro některé aplikace (sekvenování DNA) neexistuje alternativní, stejně účinná analytická technika, která by byla schopná (kapilární) gelovou elektroforézu plně nahradit.

Princip GE

Principem dělení látek v gelové elektroforéze je jejich migrace v elektrickém poli na vhodném nosiči, nejčastěji v gelu tvořeném agarózou nebo polyakrylamidem. Gel vytváří složitou polymerní síť s póry, jimiž se molekuly pohybují různou rychlostí v závislosti na velikosti (malé fragmenty se pohybují rychleji, velké pomaleji). Gel s většími či menšími póry se pro separované molekuly určité velikosti stává mechanickou překážkou. Má-li se tedy separovaná směs dělit pouze na základě velikosti nábojů, nesmí gel bránit molekulám v jejich průchodu. V případě různé velikosti separovaných molekul se pak vhodně zvolená koncentrace gelu (porosita) stává dalším faktorem ovlivňujicí separaci. Molekuly menší, než je velikost pórů nejsou v gelu zadržovány a migrují jako první (Obr. A-I). Pokud mají molekuly velikost srovnatelnou s velikostí pórů, dochází k jejich slabému zadržování v síťované struktuře (Obr. A-II), v případě velkých makromolekul je zadržování silné a molekuly migrují nejpozději (Obr.A-III). Závislost elektroforetické mobility na molekulární hmotnosti je zobrazena na Obr. B, kde jsou také vyznačeny regiony I až III. Největší pokles elektroforetické mobility nastává právě v oblasti II, kdy je velikost molekuly polymeru přibližně stejně velká jako velikost pórů gelu.

2 THETA: (A) Schematické znázornění pohybu makromolekulárních látek v gelové matrici. R-průměr molekuly, m-velikost póru.(B)-Závislost elektroforetické mobility na molekolové hmotnosti látek.(Upraveno dle [4])

Instrumentace

Gelová elektroforéza se provádí ve speciálních elektroforetických přístrojích, v nichž se gelový nosič umístí mezi dvě elektrody, mezi nimiž prochází stejnosměrný proud. Starší metoda umisťuje gelový nosič se vzorkem vertikálně v trubičkách, v novějším uspořádání je gel umístěn horizontálně v tenké vrstvě v elektroforetické vaně. Gel je elektricky spojen se zdrojem vysokého napětí pomocí platinových elektrod, které jsou umístěny v separačním elektrolytu nacházejícím se ve žlábcích po stranách gelové matrice. Vzorky se nanáší do jamek, které byly v gelu vytvořeny pomocí tzv. hřebínku. Postupně se nanese standard obsahující tzv. velikostní marker (například pro analýzu DNA je to DNA ladder = žebřík) o definované velikosti jednotlivých fragmentů a analyzované vzorky (viz Obr. ①②③). Po vložení napětí (obvykle ne více než 5-8 kV) dochází k dělení látek④⑤⑥. Po proběhnutí elektroforézy je třeba separované látky detekovat/zviditelnit. Pro vizualizaci se používá značení barvivem, např. ethidiumbromidem, koloidním stříbrem, Coomassie Blue nebo SYBR Green. Plošné uspořádání má oproti uspořádání v trubičkách několik výhod: je citlivější, lze snáze kvantifikovat rozdělené složky směsi, na destičku lze nanést větší množství vzorku (proces je efektivnější), jednotlivé vzorky lze lépe porovnávat a rozdělené vzorky lze přenést na jiný nosič (viz. blotting). Přes tyto výhody nevytlačila dosud plošná GE zcela GE v trubičkách, a to zejména proto, že uspořádání v trubičkách je jednodušší a gely je možno velice snadno připravit i málo zkušeným uživatelem. Nemalý význam pro oblibu elektroforézy v trubičkách má i fakt, že zařízení pro tento typ elektroforézy je jednodušší, a proto i podstatně levnější než pro elektroforézu plošnou.

2 THETA: Obr.(A)- Postup analýza pomocí GE: ①-jamky pro nanesení standardu a vzorku, ②③ nadávkování standardu a vzorku, ④- vložení vysokého napětí,⑤-dělení zón standardu a vzorků, ⑥-konec dělení, vyhodnocení. (B)-fotografie přístroje používaného pro gelovou elektroforézu (Jeffrey M. Vinocur, CC-BY-SA-3.0)

Typy gelů

Gelová matrice je jednou z nejdůležitějších součástí separačního systému a na jejích vlastnostech závisí úspěšnost rozdělení látek, separační účinnost, rozlišení a detekční limity. Ve většině aplikací GE se uplatňují dva typy gelů – agarosový a polyakrylamidový.

AGAROSOVÝ GEL

Agarosa je přírodní lineární polymer, který se získává z mořských řas. Řetězec agarosy obsahuje opakující se jednotky D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktopyranosy. Agarosa je schopna utvořit třírozměrnou strukturu šroubovice, která vytváří dostatečně velkou dutinu pro přijetí vody (agarosový gel může obsahovat až 99.8 % vody). Gel se připravuje v různé hustotě (udávané v % práškové agarosy). Agarosa se obvykle rozpouští v pufru, který je také obsažen v elektroforetické vaně jako elektrolyt. Ředěné agarosové gely jsou dostatečně rigidní a jednoduché pro přípravu v nízkých koncentracích, proto se typicky používají k separaci velkých makromolekul, jako např. velkých bílkovin nebo DNA (až 20 kbp). Výhodou GE na agarosovém gelu je jednoduchá a rychlá příprava gelu (roztok v příslušném pufru se pouze zahřeje a po jeho ochlazení se vytvoří gel). Oproti polyakrylmidovému gelu spočívá její další výhoda v minimální toxicitě. Nevýhodou je naopak špatná kontrola zesíťování, což vede ke vzniku rozmytých zón a nižšímu rozlišení, a také vyšší cena. Agarosový gel se připravuje ve velice nízkých koncentracích, obvykle se udává koncentrace v rozmezí 0.2 – 3% (w/v) [5]. Platí, že čím nižší koncentrace agarosy, tím rychleji látky migrují. Pro separaci velkých molekul (např. velkých fragmentů DNA) je tedy vhodné použít nízké koncentrace agarosy v gelu, naopak separace malých molekul vyžaduje použití koncentrací vyšších.

POLYAKRYLAMIDOVÝ GEL (PAGE)

Polyakrylamidové gely jsou tvořeny z monomeru akrylamidu, který je polymerizován (síťován) do dlouhých řetězců kovalentně tzv. crosslinkerem. Nejpoužívanější crosslinker je N,N’-methylenbisakrylamid. Reakce probíhá jako radikálová polymerizace iniciovaná obvykle peroxodisulfátem amonným za přítomnosti tetramethylendiaminu (TEMED), který funguje jako katalyzátor. Stupeň zesíťování monomeru určuje velikost pórů gelu čili rozsah molekulových hmotností, při kterých bude gel účinný. Polyakrylamidový gel umožňuje dělení většiny proteinů a malých oligonukleotidů do velikosti přibližně 2 kbp, nicméně volba koncentrace připraveného gelu je poměrně důležitá. Porozita může být jednoduše kontrolována vhodnou volbou poměrů monomer-crosslinker a platí, že velikost pórů klesá lineárně se zvyšující se koncentrací použitých reagentů. Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE) patří v současnosti k nejoblíbenějším elektroforetickým technikám. PAGE se velice hojně využívá především v analytice bílkovin, a to ke zjištění homogenity preparátu v různých stupních isolačního postupu a k částečné fyzikálně-chemické charakterizaci bílkovin.

DALŠÍ TYPY GELŮ

Kromě agarosy a polyakrylamidu lze pro gelovou elektroforézu použít v omezené míře i jiné typy gelů, například hydrolyzovaný škrob [6] nebo derivatizovanou celulosu [7]. V kapilární gelové elektroforéze (viz níže) se často používají například lineární polymerní gely (lineární polyakrylamid, polydimethylakrylamid) a další hydrofilní polymery – polyethylenoxid, polyvinylpyrolidon, polyethylenglykol atd [8].

Separační elektrolyt

Úspěšnost elektroforetické separace ve značné míře závisí na volbě vhodných separačních podmínek, zejména na použitém pH, které má rozhodující vliv na stupeň disociace skupin separovaných látek, a tedy i na velikost jejich náboje. Látky, které se nacházejí v izoelektrickém stavu (pH ~ pI) nenesou žádný vnější náboj a nebudou se proto v elektrickém poli pohybovat. Naopak látky nesoucí náboj se budou pohybovat směrem k opačně nabité elektrodě, tedy kationty ke katodě a anionty k anodě. Separační elektrolyty používané v GE je možné dělit dle dvou kritérií. Prvním z kritérií je jejich schopnost denaturace molekul (např. DNA). Denaturace se používá, pokud chceme snížit vliv tvaru molekuly na elektroforetickou mobilitu. Pro denaturaci DNA se používají například pufry na bázi močoviny, nebo formamidu, které naruší vodíkové vazby v DNA molekule. Dalším příkladem denaturujícího pufru je dodecylsulfát sodný, viz. SDS-PAGE níže. Hovoříme pak o denaturační gelové elektroforéze. Naopak nativní gelová elektroforéza probíhá v pufru, který neobsahuje denaturační činidla. Bílkoviny pak migrují gelem podle svého celkového náboje, velikosti a tvaru. Z hlediska složení je možné dělit separační elektrolyty na kontinuální, které se neliší svým složením od elektrolytu, ve kterém je připraven gel a diskontinuální, které mají složení odlišné. Pro kontinuální systémy se používají např. 50 mM Tris-acetátový (TAE) nebo Tris-borátový (TBE) pufr (pH 7,5-7,8). Diskontinuální separační elektrolyty slouží k zakoncentrování (stacking) vzorků do velice úzkých zón ještě před vlastní separací. Obvykle je také připraven speciální gel, který obsahuje část zakoncentrovávací s nízkou koncentrací polyakrylamidu (většími póry) o nízkém pH, a část separační s vyšší koncentrací polyakrylamidu (menšími póry) o vyšším pH. Jako příklad diskontinuálního pufru je možno uvést separační elektrolyt obsahující chloridové anionty a glycin [9].

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE)

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS ) je elektroforetický způsob separace látek striktně na základě jejich velikosti a využívá se převážně pro dělení bílkovin. SDS je anionaktivní detergent, který slouží jako denaturační činidlo. Hydrofóbní konec molekuly SDS inteaguje s proteinovým řetězcem. Protože SDS nese poměrně vysoký náboj, ve vazbě na bílkovinu vyrovnává nábojové rozdíly bílkovin a ty se pohybují v gelu jen podle jejich velikosti. SDS se váže na bílkovinu v konstantním poměru: neredukované bílkoviny vážou přibližně 0.9-1.0 g SDS na 1g bílkoviny, redukované bílkoviny (použije se zároveň ß-merkaptoethanol pro redukci disulfidických vazeb) vážou asi 1,4g SDS na 1g bílkoviny. Výsledné komplexy SDS-bílkovina pak mají stejnou hodnotu povrchového náboje a jejich konformace se do té míry unifikuje tak, že relativní molekulová hmotnost bílkoviny odpovídá velikosti jejího komplexu s SDS.

2 THETA: Obr. Struktura dodecylsulfátu sodného (SDS).

Experimentálně byla prokázána přímá úměra mezi elektroforetickou pohyblivosti komplexů SDS-bílkovina v polyakrylamidovém gelu a logaritmem relativní molekulové hmotnosti (MW). Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je možné poměrně přesně určit její MW, například na základě tzv. Fergusonova grafu [10]. Takto stanovené hodnoty MW se obecně uznávají pro účely charakterizace bílkovinného preparátu.

Detekce

Po separaci v gelové elektroforéze není obvykle analyt prostým okem detekovatelný a je potřeba jej zviditelnit. Pro kvantifikaci (určení množství analytu v zóně) používáme často metody vybarvování gelu (staining), radioaktivní značení nebo hybridizaci se značenou sondou. Nejvíce používanou metodou je vybarvování. Tabulka poskytuje přehled nejčastěji používaných činidel. Vybarvování bílkovin je prováděno běžně dostupnými reagenciemi: Amido Black, Coomassie Brilliant Blue G-250 nebo stříbrem, které se liší citlivostí. Vybarvování stříbrem je ca 400x citlivější než Amido black a používá se převážně pro polyakrylamidové gely. Pro vizualizaci DNA/RNA se používá značení barvivem, které se váže na DNA, např. ethidiumbromid nebo SYBR Green a které fluoreskuje po ozáření UV/VIS světlem. SYBR Green (λabs = 497 nm, λem=520 nm) je přibližně 25x citlivější než ethidiumbromid (λabs1 = 210, λabs2 = 285 nm, λem=605 nm).

2 THETA Tabulka Použivaná barviva

Blotting

Technika „Blotting“ spočívá v přenosu bílkovin z gelu do jiné matrice, např. na nitrocelulózový papír, PVDF nebo nylonovou membránu, protože jinak by síť gelu bránila jiným molekulám (např. bílkovinným protilátkám) s bílkovinami rychle a kvantitativně reagovat, což je právě proces, který se využívá k citlivé detekci. Existuje celá řada reakcí typu blotting (Southern blotting, western blotting, northern blotting, reverse nothern blotting atd.). Metoda Southern blotting (pojmenovaná po jejím vynálezci, Edwinu Southernovi) se používá v molekulární biologii ke stanovení specifické sekvence DNA. Nosič s přenesenou DNA je inkubován se značenou DNA (radioaktivní nebo fluorescenční značení) komplementární k DNA, kterou stanovujeme. Northern blotting používá obdobný postup, ale s RNA. Umožňuje např. studium genové exprese určitého genu kdy použitá sonda hybridizuje specifický úsek mRNA vzniklé transkripcí genu. Western blotting je metoda detekce specifických bílkovin v biologickém materiálu, kdy papír s přeneseným analytem reaguje se specifickou protilátkou.

Dvoudimenzionální (2D) gelová elektroforéza

2D elektroforéza je vysoce účinná separační metoda, sloužící k identifikaci a stanovení bílkovin ve velice složitých směsích. 2D-GE používá dvě po sobě následující elektroforetické metody: izoelektrickou fokusaci (IEF) a SDS-PAGE elektroforézu. Izoelektrická fokusace je prováděna nejdříve v jednom směru (osa x), kdy jsou separovány látky dle svých isoelektrických bodů (pI) a následuje SDS-PAGE ve směru kolmém (osa y), kdy se látky dělí podle molekulových hmotností. Takto lze odlišit i proteiny lišící se pouze o jediný náboj. Vzniklé dvourozměrné proteinové mapy (Obr. 8.31) lze po naskenování katalogizovat a použít jako identifikační nástroj. Metoda nachází využití při analýze velice podobných vzorků, které se liší pouze přítomnosti několika málo bílkovin (např. pro identifikaci bílkoviny, která se se účastní obranného mechanismu rostlin).

2 THETA: Příklad dvourozměrné proteinové mapy získané 2D-gelovou elektroforézou [13].

Kapilární gelová elektroforéza (CGE)

Kapilární gelová elektroforéza (CGE) je analogií tradiční gelové elektroforézy. Obdobně jako GE se používá pro dělení biologických makromolekul, oligonukleotidů, DNA fragmentů a proteinů. Separace se provádí v křemenné kapiláře o vnitřním průměru několika desítek mikrometrů naplněné gelovou matricí, který zvyšuje rozdíly mezi elektroforetickými mobilitami dělených molekul různých tvarů, které jsou nuceny migrovat póry gelu. Přítomnost gelu zabraňuje vzniku elektroosmotického toku a také umožňuje účinný odvod tepla vzniklého v důsledku průchodu elektrického proudu separačním elektrolytem. V kapilární gelové elektroforéze lze na rozdíl od gelové elektroforézy v plošném uspořádání použít i lineární polymerní gely. Původně používané zesíťované polymery, navázané kovalentně na stěny kapiláry, sice umožňují vysoce účinné separace látek, převážně bílkovin a krátkých fragmentů DNA, jejich regenerace v kapiláře je však problematická a vzorek lze nadávkovat pouze elektrokineticky. Lineární polymerní gely [14] nejsou uchyceny na stěnu kapiláry a po skončení analýzy je lze jednoduše z kapiláry vymýt pomocí hydrodynamického tlaku. Lze proto dávkovat vzorky jak elektrokineticky, tak hydrodynamicky, což je nesporná výhoda. Příkladem těchto gelů jsou lineární polyakrylamid, polydimethylakrylamid, derivatizovaná celulosa (hydroxypropylcelulosa, hydroxyethylcelulosa), polyethylenoxid, polyvinylpyrolidon, polyethylenglykol [8] atd. Hlavní výhodou kapilární gelové elektroforézy oproti klasické gelové elektroforéze je vyšší separační účinnost (lze použít několikanásobně vyšší napětí než u gelové elektroforézy), širší škála aplikovatelných gelů a on-line detekce (molekuly jsou separovány a detekovány během jednoho experimentu). Z výše uvedených výhod vyplývá i lepší kvantifikovatelnost a možnost automatizace, (viz automatické sekvenátory sloužící k určení pořadí nukleových bází). V poslední době se uplatňuje také gelová elektroforéza na čipech, která poskytuje několikanásobně kratší analýzy [15].

DNA SEKVENOVÁNÍ POMOCÍ KAPILÁRNÍ GELOVÉ ELEKTROFORÉZY

Sekvenace je souhrnný termín pro biochemické metody, které slouží k určení pořadí nukleotidů (A, C, G, T) v krátkých sekvencích DNA, které jsou součástí dědičné informace a patří mezi nejrozšířenější způsoby analyzování biologického materiálu. Sekvenování DNA patří již řadu let ke standardním metodám molekulárněgenetických analýz. Analýzou nalezené sekvence je možné získat informace relevantní např. k původu geneticky podmíněných onemocnění. V medicíně nachází sekvenování DNA široké uplatnění, zejména v oblasti diagnostiky dědičných chorob a nádorových onemocnění. Pro sekvenování byly vyvinuty dvě metody –chemická Maxam-Gilbertova a biochemická Sangerova, která dnes jednoznačně převládá. Maxam-Gilbertova metoda [16] je založena na chemické modifikaci DNA a následném štěpení DNA na nukleotidech, kde proběhla tato modifikace. Sangerova metoda [17] vyžaduje jednovláknovou DNA, která slouží jako templát pro syntézu druhého komplementárního řetězce. Reakce probíhá za přítomnosti enzymu DNA polymerázy a je upravena tak, že v určitých místech dochází v závislosti na sekvenci templátového vlákna k ukončení syntézy. K tomuto ukončení vlákna DNA se využívají dideoxynukleotidy (ddNTP). Délku nedokončených úseků komplementárního vlákna lze zjistit pomocí elektroforézy v gelu a odpovídá vzdálenosti od začátku vlákna, ve které se vyskytl určitý nukleotid. Výhodné je použít kapilární gelovou elektroforézu, která umožňuje sekvenaci v jedné reakci. Každý ddNTP (popř. primer) je značen jiným fluorescenčním barvivem a elektroforéza probíhá v jedné křemenné kapiláře. Příklad analýzy pomocí automatického sekvenátoru je na Obr. níže.

2 THETA: Obr. Výsledek sekvenace úseku DNA automatickým sekvenátorem za pomocí Sangerovy metody . Každý ze čtyř nukleotidů je značen jiným fluorescenčním činidlem a z elektroferogramu lze určit jejich sekvenci [18].

V praxi se jedná se o nejčastěji používanou sekvenační technologii, která se stala se základem světového projektu čtení lidského genomu (Human Genome Project [19]). Kromě lidského genomu byly přečteny také genomy mnoha jiných organismů, včetně různých rostlin, živočichů a mikrobů. Sekvenace DNA je ale užitečná nejen v základním výzkumu biologických procesů, ale i v aplikovaných oborech, jimiž je diagnostika nemocí či forenzní medicíně.

Závěr

Gelová elektroforéza představuje rutinní metodu, která je používaná v celé řadě oborů jako jsou klinická analýza, forenzní analýza, analýza biologických a rostlinných materiálů atd. GE je používána k separaci a kvantifikaci makromolekul, DNA, RNA a bílkovin. Dělení, identifikace a kvantifikace fragmentů DNA slouží například k odhalení genetických mutací (srpkovité anemie, Huntingtonovy nemoci, svalové dystrofie), odhalení rakoviny, určení otcovství na základě analýzy DNA, stanovení genetické příbuznosti a také k analýze vzorků odebraných na místě činu ve forenzní analytice. Analog gelové elektroforézy, kapilární gelová elektroforéza vhodně doplňuje oblasti použití GE a je nepostradatelná především na poli sekvenování DNA. Sekvenace lze využít v mnoha oborech jako antropologii, zemědělství, fylogenetice, kriminalistice a obzvláště v lékařství. Sekvenační metody se v posledních letech začaly využívat například k sekvenování v nádorové genetice. Je zvažováno i následné využití v klinické genetice člověka u různých typů onemocnění, protože identifikace genetických změn může vést k urychlení objevu nových léčebných postupů. GE a CGE tedy představují nepostradatelnou rutinní analytickou techniku pro analýzu makromolekulárních látek, jejíž význam bude v blízké budoucnosti pravděpodobně narůstat.