Organická analýza - kapalinová chromatografie (LC) 3/4
Foto: 2 Theta: Organická analýza
5.6 Chromatografické fázové systémy
- 5.6.1 Chromatografie v systémech s obrácenými (převrácenými) fázemi
- 5.6.2 Chromatografie v systémech s normálními fázemi
- 5.6.3 Iontově-výměnná chromatografie, iontová chromatografie a chromatografie iontové výluky
- 5.6.4 Chromatografie prostorové výluky
- 5.6.5 Separace založené na tvorbě komplexů, chirální separace, bioafinitní chromatografie
5.7 Vývoj a optimalizace pracovních podmínek při HPLC
5.8 Programované a kombinované HPLC separační techniky
- 5.8.1 Gradientová eluce
- 5.8.2 Dvourozměrná kapalinová chromatografie
5.9 Závěr
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
Chromatografické fázové systémy
Kombinaci použité stacionární a mobilní fáze označujeme jako chromatografický systém. Interakce mezi složkami vzorku, mobilní a stacionární fází určují mechanismus retence a separace jednotlivých složek vzorku. Podle převažujících interakcí můžeme rozlišit čtyři základní typy (módy) kapalinové chromatografie:
- I. Chromatografie v systémech s normálními fázemi (NP LC);
- II. Chromatografie v systémech s obrácenými (převrácenými) fázemi (RP LC);
- III. Chromatografie iontové výměny (IE LC)
- IV. Chromatografie prostorové výluky (gelová chromatografie, SEC)
Vedle těchto základních módů se používají i speciální techniky, např. bioafinitní chromatografie, chirální HPLC, micelární HPLC, chromatografie ligandové výměny, aj. [30].
Chromatografie v systémech s obrácenými (převrácenými) fázemi
Chromatografie v systémech s převrácenými fázemi (RP LC) je technikou první volby v současné praxi HPLC, protože se hodí pro dělení látek, které se liší velikostí hydrofobních částí molekul, např. členů homoogických nebo oligomerních řad, umožňuje ale i separace velmi pestré škály nepolárních, středně nebo silně polárních a někdy i iontových látek, lišících se počtem a charakterem alkylových či středně polárních substituentů, od aromatických uhlovodíků až po silně polární cukry či peptidy, proteiny, oligonukleotidy. Separace je založena především na nepolárních (disperzních) interakcích mezi analyzovanými látkami, mobilní i stacionární fází.
Stacionární fáze nejčastěji obsahují nepolární oktadecylové, oktylové, či jiné alkylové a alkylarylové skupiny chemicky vázané na silikagelu, případně i mírně polární, např. nitrilové skupiny.
V RP systémech se mobilní fáze skládá se většinou z vody a jednoho či více polárních rozpouštědel, nejčastěji methanolu nebo acetonitrilu. Eluci látek urychluje klesající polarita a rostoucí koncentrace organického rozpouštědla, které mohou ovlivňovat i selektivitu separace. Značně lipofilní látky, které se ve vodně-organických fázích velmi silně zadržují, např. estery mastných kyselin lze často separovat v systémech tzv. bezvodé chromatografie s převrácenými fázemi (non-aqueous reversed-phase chromatography, NARP) s mobilními fázemi, obsahujícími pouze organická rozpouštědla (např. acetonitril a dichloromethan) [30].
Chromatografie v systémech s normálními fázemi
V systémech s normálními fázemi (NP LC) se používají polární stacionární fáze, buď anorganické polární adsorbenty (nejčastěji silikagel, ale i oxid hlinitý), či polární fáze (aminové, nitrilové, diolové, nitro a další) chemicky vázané na povrchu anorganického adsorbentu. Adsorpce vzorků na aktivních polárních centrech (volné hydroxylové skupiny, aj.) roste se specifickým povrchem polárních anorganických adsorbentů. Velikost retence lze nejsnadněji ovlivnit volbou mobilní fáze, nejčastěji dvousložkové směsi organických rozpouštědel s různou polaritou (např. propanol a n-hexan), které jsou méně polární než fáze stacionární. Polární adsorpční centra se desaktivují v přítomnosti vody, která se na nich přednostně adsorbuje. Při použití vysušených rozpouštědel retence roste. Zvýšení koncentrace polárního rozpouštědla urychlí eluci. Selektivitu separace lze ovlivňovat i použitím vícesložkových organických mobilních fází.
Látky se eluují v pořadí rostoucích polarit, to znamená s rostoucím počtem a polaritou funkčních skupin v molekulách. Adsorpční chromatografie v organických mobilních fázích se používá především pro separace středně a málo polárních látek, které se liší počtem a polohou polárních funkčních skupin, zejména izomerů, které vykazují různě silné interakce s adsorpčními centry na povrchu adsorbentu [34].
Pokud se polární látky v čistě organických mobilních fázích příliš silně zadržují, lze k separaci v systémech s normálními fázemi často využít vodně-organických mobilních fází, při technice označované jako chromatografie hydrofilních interakcí (HILIC).
2 Theta: Obr. Struktury vybraných stacionárních fází pro HILIC chromatografii
Iontově-výměnná chromatografie, iontová chromatografie a chromatografie iontové výluky
Iontově-výměnná chromatografie (IE LC) je starou chromatografickou technikou separace iontových látek, která je založená na elektrostatických interakcích mezi iontově-výměnnými skupinami ionexů, opačně nabitými ionty separovaných látek a tzv. protiionty v mobilní fázi. K separaci kationtů (protonovaných bazických látek) slouží silné katexy se záporně nabitými sulfonovými skupinami, nebo slabé katexy, většinou s karboxylovými skupinami. Anionty silných či slabých kyselin lze separovat na silných anexech s kvarterními amoniovými výměnnými skupinami nebo na slabých anexech s terciárními nebo sekundárními aminoskupinami, např. trimethylamoniovými nebo diethylaminoethylovými. Silné ionexy jsou ionizovány v celé oblasti pH, slabé katexy pouze v alkalické a slabé anexy pouze v kyselé oblasti [37]. Starší typy ionexů měly organickou polymerní matrici, většinou buď hydrofóbní styren-divinylbenzenový kopolymer, nebo hydrofilní - např. ethylenglykol-methakrylátový gel. Novější typy ionexů obsahují iontově-výměnné skupiny chemicky vázané na povrchu silikagelu, které jsou odolnější při vyšším pracovním tlaku, ale - jako všechny stacionární fáze na bázi silikagelu – podléhají hydrolýze při vyšším pH, které je často třeba pro úspěšnou separaci aniontů. Iontově-výměnná chromatografie je založena na Coulombických interakcích, které mají za následek stechiometrickou reakci.
Uspokojivé řešení přinesly až práce Smalla, Stevense a Baumana v polovině sedmdesátých let mibulého století, kteří popsali separaci směsi anorganických aniontů na ionexech s konduktometrickou detekcí. Autoři tuto techniku označili názvem iontová chromatografie (IC) [38].
Při chromatografii iontové výluky se využívá odpudivých interakcí mezi stejně nabitými ionty a iontově-výměnnými skupinami ionexu (Donnanův efekt). Na rozdíl od IEC techniky zde retence klesá s rostoucí ionizací a počtem iontových skupin ve vzorku. Techniky vysolovací chromatografie (podle analogie s vysolením organických látek při jednorázových extrakcích kapalinou) lze využít pro separace iontových látek, které se liší velikostí uhlovodíkové části molekuly na stacionárních fázích s alkyly chemicky vázanými na silikagelu.
Chromatografie prostorové výluky
Při chromatografii prostorové výluky (size-exclusion chromatography, SEC), často označované jako gelová chromatografie, se látky dělí podle rozdílů přístupnosti objemu pórů v koloně pro různě velké molekuly. Technika tedy slouží především pro separace syntetických makromolekul nebo biopolymerů. Pracuje s kolonami plněnými hydrofilními či lipofilními gely (podle polarity separovaných vzorků). Distribuce vnitřních pórů určuje velikost molekul, které mohou pronikat dovnitř, musí být proto dobře definována. V ideálním případě gely neobsahují žádné skupiny, které by mohly se vzorky aktivně interagovat a látky se eluují v pořadí klesajících molekulárních hmotností, Mr, mezi elučním objemem odpovídajícím mezičásticovému objemu mobilní fáze a celkovým objemem mobilní fáze v koloně - mezi částicemi i uvnitř pórů. SEC chromatografie se tradičně používá pro charakterizaci distribuce Mr polymerů [42].
Separace založené na tvorbě komplexů, chirální separace, bioafinitní chromatografie
V kapalinové chromatografii se občas využívá komplexotvorných rovnováh, jichž se účastní separované látky ve stacionární nebo v mobilní fázi. Po přídavku vhodného komplexotvorného činidla k mobilní fázi, např. kovových iontů nebo aniontů nižších karboxylových kyselin nebo hydroxykyselin, některé látky mohou vytvářet komplexy, které se liší retencí od volných látek. To lze využít k ovlivnění retence a selektivity separace složek vzorku. Příkladem může být např. zvýšení selektivity separace některých lipidů nebo karotenoidů a dalších látek, které se lišící počtem a polohou dvojných vazeb při argentační chromatografii, kde se využívá tvorby π-elektronových komplexů stříbrných iontů, zpravidla vyloučených na povrchu silikagelu [44]. Chromatografie ligandové výměny využívá kovových iontů (např. Cu²⁺ nebo Ni²⁺) či jejich chelátů, imobilizovaných ve stacionární fázi, nebo přidaných do mobilní fáze. Látky, které mají dvě polární skupiny v molekule vhodně prostorově rozmístěny, např. alifatické aminoalkoholy nebo aminokyseliny, vytvářejí s nimi komplexy, které se eluují v pořadí klesající stability. Tato technika se však vyznačuje nízkou separační účinností a její praktický význam je omezený [45].
Na distribuci separovaných látek mezi nepolární stacionární fázi, vodnou mobilní fází a micelární "pseudofází" je založena micelární kapalinová chromatografie.
Chirální separace umožňují rozlišit optické izomery (což má zvláštní význam u léčiv, kde se enantiomery mohou lišit terapeutickými i toxickými vlastnostmi). Využívá se specifických prostorových interakcí enantiomerů s chirálními činidly (selektory).
Bioafinitní chromatografie využívá biospecifických interakcí typu klíč - zámek mezi tvarově komplementárními dvojicemi antigen - protilátka, inhibitor - enzym, atp. Jedna partnerská látka je imobilizována ve stacionární fázi a slouží k selektivnímu záchytu, k obohacení a izolaci druhého partnera s komplementární strukturou.
Vývoj a optimalizace pracovních podmínek při HPLC
Při vývoji HPLC metody je třeba nastavit řadu pracovních podmínek, které ovlivňují separaci tak, aby bylo dosaženo separace všech významných složek vzorku, pokud možno v co nejkratším čase analýzy [50]. U složitých vzorků je velmi důležitý počet látek, které lze na jednom chromatogramu rozlišit, tzv. píková kapacita, která závisí na počtu teoretických pater kolony a na retenčních časech první a poslední eluované látky.
Programované a kombinované HPLC separační techniky
Gradientová eluce
Separujme-li složité vzorky při časově stálých podmínkách, t.j. izokratickou elucí, slabě zadržované látky se mohou vzájemně špatně dělit, nebo se některé složky vzorku mohou příliš silně zadržovat. Tento "obecný problém eluce" lze řešit programováním pracovních podmínek v průběhu separace vzorku tak, aby se retence látek v průběhu eluce snižovala. K tomu můžeme využít programu časové změny průtoku nebo teploty. Zvýšení teploty o 1-2°C často vede ke snížení retenčních faktorů malých molekul o 1 %. Mnohem účinnější je programování složení mobilní fáze při gradientové eluci.
Dvourozměrná kapalinová chromatografie
Kvalitu separace lze zlepšit i kombinací různých kolon ve dvourozměrné kapalinové chromatografii - 2D HPLC. V „off-line“ uspořádání izolujeme frakce eluátu z první kolony a po úpravě objemu dávkujeme na druhou kolonu. Při přímém "in-line" spojení dvou různých kolon v sérii odebíráme eluát z první kolony v malých frakcích, které přímo převádíme na druhou kolonu. Při tzv. „heart-cut“ technice (LC-LC) podrobíme analýze ve druhé dimenzi jen vybrané frakce. Při úplné comprehensive) LCxLC chromatografii postupně projdou oběma kolonami všechny složky vzorku a teoreticky je možno dosáhnout separace celkového počtu látek, který je roven násobku počtu rozdělených píků v první a druhé dimenzi
Pro dvourozměrné separace v reálném čase při přímém (on-line) spojení dvou LC systémů je nezbytné, aby separace na druhé koloně proběhla velmi rychle, během jedné minuty nebo i v kratší době, v čase, který je k dispozici pro sběr následující frakce z první dimenze ve smyčce ventilu použitého jako rozhraní mezi oběma kolonami.
Závěr
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je jedním z nejpoužívanějších a nejužitečnějších nástrojů pro řešení různých typů problémů organické analýzy. Na rozdíl od ostatních separačních technik HPLC umožňuje separace širokého spektra kapalných a tuhých vzorků látek různých polarit a molekulárních hmotností, od malých molekul (s výjimkou plynů) až po biopolymery a syntetické polymery, jak uhlovodíky, tak i polární a iontové látky. To je dáno velkým výběrem možných kombinací různých stacionárních a mobilních fází i detekčních metod, i když standardním HPLC systémem první volby, který často poskytne úspěšný výsledek, je separace na koloně s oktadecylovou fází chemicky vázanou na silikagelu, vodným acetonitrilem jako mobilní fází a spektrofotometrickým UV detektorem.
- [1] L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.W. Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3. vydání, Wiley, Hoboken, NJ, 2009.
- [2] C.F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, 2002.
- [3] J.R. Mazzeo, et al., Anal. Chem., 77 (2005) 460A.
- [4] G. Guiochon, A. Felinger, D.G. Shirazi, A.M. Katti, Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography, 2. vydání, Elsevier, 2006.
- [5] C.F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, 2002.
- [6] J. J. Van Deemter, F. J. Zuiderweg, A. Klinkenberg, Chem. Eng. Sci. 5 (1956) 271.
- [7] U.D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology and Practice, Wiley-VCH, New York 1997.
- [8] M.V. Novotny and S. Ishii, editors, Microcolumn Separations, Elsevier, Amsterdam 1985.
- [9] M. Vollmer, P. Horth, G. Rozing, Y. Coute, R. Grimm, D. Hochstrasser, J.C. Sanchez, J. Sep. Sci., 29 (2006) 499.
- [10] J.J. DeStefano, S.A. Schuster, J.M. Lawhorn, J.J. Kirkland, J. Chromatogr. A, 1258 (2012) 83.
- [11] H. Minakuchi, K. Nakanishi, N. Soga, N. Ishizuka, N. Tanaka, Anal. Chem. 68 (1996) 3498.
- [12] F. Švec, C.G. Huber, Anal. Chem., 78 (2006) 2100.
- [13] K. Karch, I. Sebastian, I. Halász, J. Chromatogr., 122 (1976) 3.
- [14] K.K. Unger K.K, Porous Silica. Amsterdam, Elsevier, 1979.
- [15] J.J. Kirkland, J. Chromatogr. Sci., 15 (1977) 393.
- [16] J.J. Kirkland, J.B. Adams, M.A. van Straten, H.A. Claessens, Anal. Chem., 70 (1998) 4344.
- [17] U.D. Neue, T.H. Walter, B.A. Alden, Z. Jiang, R.P. Fisk, J.T. Cook, K.H. Glose, J.L. Carmody, J.M. Grassi, 42. J.S. Mellors, J.W. Jorgenson, Anal. Chem., 76 (2004) 5441.
- [18] J.J. Pesek, M.T. Matyska, M. Oliva, M..E. Vanchic, J. Chromatogr. A, 818 (1997) 145.[13] J.E. O ́Gara, B.A. Alden, T.H. Walter, J.S. Petersen, C.L. Niederlander, U.D. Neue, Anal. Chem., 67 (1995), 3809.
- [19] T.P. Weber, P.W. Carr, E.F., Funkenbusch, J. Chromatogr. A, 519 (1990) 31.
- [20] V.R. Mayer, „Practical High-Performance Liquid Chromatography“ (5. vydání Wiley, 2010).
- [21] L.R. Snyder, J.L. Glajch, J.W. Dolan Introduction to Modern Liquid Chromatography (3. vydání, Wiley, 2009).
- [22] J. Churáček, P. Jandera, J. Krupčík, K. Polonský, M. Popl, F.Vláčil: “Analytické separace látek” SNTL Praha, 1990.
- [23] P. Jandera, J. Churáček, Gradient Elution in Column Liquid Chromatography. Elsevier, Amsterdam 1985.
- [24] L.R. Snyder, J.W. Dolan, High-performance Gradient Elution. The Practical Application of the Linear-solvent-strength Model. Hoboken, N.J.: Wiley-Interscience, 2007.
- [25] J. Churáček, P. Jandera „Úvod do vysokoúčinné kapalinové chromatografie“ SNTL Praha, 1984
- [26] R.P.W. Scott, Liquid Chromatography Detectors, Elsevier, Amsterdam 1986.
- [27] D. Asa, Amer. Lab., 38(7) (2006) 16.
- [28] K. Albert, J. Chromatogr. A, 856 (1999) 199.
- [29] W.M.A. Niessen, Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, 3rd. ed., Taylor and Francis, London, 2006.
- [30] P. Jandera, Comparison of various modes and phase systems for analytical HPLC, v knize: Klara Valko, editor, Separation Methods in Drug Synthesis and Purification, Elsevier, Amsterdam, 2000, str. 1-71.
- [31] U.D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology and Practice, Wiley-VCH, New York 1997.
- [32] L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.W. Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd ed., Wiley, Hoboken, NJ, 2009.
- [33] P. Jandera, J. Churáček, B. Taraba, J. Chromatogr., 262 (1983) 121.
- [34] L.R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker, New York, 1968.
- [35] A.J. Alpert, P.C. Andrews, J. Chromatogr., 443 (1988) 85.
- [36] P. Jandera, Anal. Chim. Acta, 692 (2011) 1.
- [37] P. Jandera and J. Churáček, Adv. Chromatogr., 19 (1981) 125.
- [38] Small, H., Stevens, T.S., Bauman, W.C., Anal. Chem. 47, 1975, 1801.
- [39] H. Small, Ion Chromatography, Plenum Press, New York, 1989.
- [40] P. Jandera, J. Churáček, J. Chromatogr., 197 (1980) 181.
- [41] J. Porath, Biochem. Biophys. Acta, 39 (1960) 193.
- [42] J. Janča (Ed.): Steric Exclusion Liquid Chromatography of Polymers, Marcel Dekker, New York, 1984.
- [43] H. Determann, Gelová chromatografie (český překlad) Academia, Praha 1972.
- [44] C.R. Vogt, J.S. Baxter, T.R. Ryan, J. Chromatogr. 150 (1978) 93.
- [45] F.K. Chow, E. Grushka, J. Chromatogr. 185 (1979) 361.
- [46] A. Berthod, M. Ruiz-Angel, S. Carda-Broch, J. Chromatogr. A 1184 (2008) 6.
- [47] G. Subramanian (Ed.), Chiral Separation Techniques, Wiley-VCH, Weinheim, 2007.
- [48] J. Turková, Affinity Chromatography, Elsevier, Amsterdam 1978.
- [49] M. Lasáková, P. Jandera, J. Separation Sci., 32 (2009) 799
- [50] L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development, 2nd ed., Wiley-Interscience, New York 1997.
- [51] P.J. Schoenmakers: Optimisation of Chromatographic Selectivity, Elsevier, Amsterdam 1986.
- [52] P. Jandera, Comparison of various modes and phase systems for analytical HPLC, v knize: Klara Valko, - editor, Separation Methods in Drug Synthesis and Purification, Elsevier, Amsterdam, 2000, str. 1-71.
- [53] P. Jandera and J. Churáček, Adv. Chromatogr., 19 (1981) 125.
- [54] P. Jandera, J. Churáček, Gradient Elution in Column Liquid Chromatography. Elsevier, Amsterdam 1985.
- [55] L.R. Snyder, J.W. Dolan, High-performance Gradient Elution. The Practical Application of the Linear-solvent-strength Model. Hoboken, N.J.: Wiley-Interscience, 2007.
- [56] P. Jandera, J. Churáček: Kapalinová chromatografie s programovaným složením mobilní fáze. Academia, Praha 1984.
- [57] S.A. Cohen, M.R. Schure (Ed.), Multidimensional Liquid Chromatography. Hoboken, N.J.: Wiley- Interscience, 2008.
- [58] L. Mondello (Ed.) Comprehensive chromatography in combination with mass spectrometry, Hoboken, N. J.: Wiley-Interscience 2011.
- [59] P. Jandera, J. Chromatography A, 1255 (2012) 112.
- [60] P. Česla, T. Hájek and P. Jandera, J. Chromatogr.A, 1216, (2009) 3443.
- [61] L. Nováková, M. Douša a kol., Moderní HPLC separace v teorii a praxi I, II, vlastním nákladem, Praha 2013
