Tipy a triky v HPLC: Optimalizace extrakce tuhá látka-kapalina a úprava extraktu v HPLC

Extrakce látek se provádí organickými rozpouštědly o různé polaritě či mobilní fází přímo. Získané extrakty jsou následně přečištěny na pevné fázi nebo jsou použity přímo k nástřiku na analytickou kolonu. Při přímé chromatografii bez předúpravy extraktu se u nízkých koncentrací látek začíná již projevovat matrix efekt na analytické koloně a není zaručeno dokonalé rozlišení či baselinová separace těchto látek, nemluvě o možných ireverzibilních vazbách na sorbentu analytické kolony. V tomto případě je použití předkolony nevyhnutelné. Dále uvedeme několik způsobů (jednoduchých i složitějších) optimalizace extrakce a úpravy extraktu.

1. Reextrakce kapalina-kapalina

Nejednodušší a nejrychlejší krok k odstranění těchto matrix efektů může být změna extrakčního rozpouštědla.

Změnou polarity rozpouštědla můžeme docílit toho, že do extraktu jsou extrahovány pouze látky omezené polaritou daného rozpouštědla a ostatní látky zůstanou nerozpuštěny. Tento postup je velmi jednoduchý a může být patřičně efektivní (je-li nízké rozlišení R₁ˌ₂ < 1,5) v případě, že se nám podaří extrakcí změnou rozpouštědla odstranit interferující látky.

Velmi jednoduché a efektivní je také použití reextrakce v systému kapalina-kapalina. Jako příklad uvádím stanovení sulfachinoxalinu, kdy je extrakt sulfachinoxalinu (chromatogram 1) přečištěn reextrakcí do dichlormethanu (chromatogram 2).

HPLC.cz: Chromatogram 1: Stanovení sulfachinoxalinu, kolona 3,9 x 150 mm C18

HPLC.cz: Chromatogram 2: Stanovení sulfachinoxalinu, reextrakce do dichlormethanu, kolona 3,9 x 150 mm C18

2. SPE (solid phase extraction) – extrakce na pevné fázi

V případě, že předchozí krok není dostatečný, nezbývá nic jiného, než použít přečištění extraktu na pevné fázi (SPE).

Nejčastěji se využívá jako pevná fáze silikagel (silica) či oxid hlinitý (alumina) (polární fáze) nebo reverzní fáze C18 (nepolární fáze).

Použití pevné fáze jako předseparace extraktu má dvě přednosti:

• můžeme zbavit extraktu nežádoucích látek, které by mohly rušit stanovení dané látky (matrix efekt) nebo látek, které mají velký retenční objem

• dále můžeme extrakt zakoncertovat

Nevýhodou je operace s pevnou fází jako krok navíc, který se zavádí do analytického postupu a možný zdroj chyb (adsorbce na pevné fázi, ztráty z důvodu přetížení separační kolonky).

Jako příklad přečištění na pevné fázi uvedu optimalizaci extrakce a přečištění extraktu při stanovení lasalocidu v krmivech.

1. Lasalocid se extrahuje ze vzorku směsným rozpouštědlem methanol-voda-kyselina fosforečná a takto získaný extrakt se použije přímo k nástřiku na chromatografickou kolonu (chromatogram 3).

HPLC.cz: Chromatogram 3: Separace lasalocidu extraktu methanol-voda-kyselina fosforečná

2. Z chromatogramu je zřejmé, že nedochází k dostatečnému rozlišení a je nutné optimalizovat buď separaci na chromatografické koloně nebo extrakci vzorku.

Budeme se soustředit na druhou část – extrakci lasalocidu ze vzorku. K extrakci se použije směsné rozpouštědlo hexan-octan ethylnatý (8+2). Tento extrakt se jednak převede do mobilní fáze a nanáší se přímo na chromatografickou kolonu (chromatogram 4).

HPLC.cz: Chromatogram 4: Separace lasalocidu bez přečištění extraktu na SPE Silica

3. Druhý podíl extraktu se přečistí na pevné fázi Silica. Jako promývací roztok je zvolen dichlormethan, tato první frakce je převedena do mobilní fáze a nanesena na chromatografickou kolonu (chromatogram 5).

HPLC.cz: Chromatogram 5: Separace lasalocidu. 1. frakce z pevné fáze SPE Silica

Lasalocid je eluován z kolonky silica elučním roztokem dichlormethan-methanol (9+1), extrakt je převeden do mobilní fáze a nanesen na chromatografickou kolonu (chromatogram 6).

HPLC.cz: Chromatogram 6: Separace lasalocidu. 2. frakce z pevné fáze SPE Silica

Tímto postupem jsme odstranili možné interferující látky a následně jsme mohli konečný extrakt zakoncentrovat (nanesením 10,0 ml extraktu na SPE a rozpuštěním v konečném objemu 2,0 ml mobilní fáze - tj. 5krát).

3. Optimalizace chromatografických podmínek

Zvýšení selektivity a citlivosti detekce můžeme dosáhnout změnou podmínek detekce nebo detekce vůbec.

Nejjednodušší a klasický příklad je použití fluorescenční detekce namísto detekce UV-VIS, která je daleko méně citlivá a selektivní.

V případě, že nemáme tuto možnost pak druhou možností je optimalizace vlnové délky ze znalosti absorpční křivky dané látky v daném rozpouštědle.

Mnohdy použití absorpčního maxima se nejeví jako nejideálnější a vhodnější je použití (je-li k dispozici) druhého či třetího absorpčního maxima posunutého zejména k vyšším vlnovým délkám i když molární absorpční koeficient je nižší.

Jako příklad uvádím stanovení olachindoxu při dvou vlnových délkách - 260 nm a 372 nm (chromatogram 7), kdy první absorpční maximum je právě při 260 nm a třetí absorpční maximum, které je posunutu k vyšším vlnovým délkám a λ₃ = 372 nm. Z chromatogramu je evidentní, že použití vlnové délky 372 nm je daleko selektivnější než vlnová délka 260 nm.

HPLC.cz: Chromatogram 7: Separace olachindoxu. A - 372 nm, B - 260 nm