Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Výsledky práce potvrdily, že i v případě stanovení α- a β-hořkých kyselin zajišťuje technika UHPLC rychlejší průchodnost vzorků laboratořemi. Dalším přínosem je snížení nejistoty výsledku stanovení, které je spojeno s nesrovnatelně vyšší separační schopností UHPLC systému. Zatímco původní HPLC metodou přejatou z Analytiky EBC 7.7 jsme schopni 6 analyzovaných hořkých látek rozdělit pouze ve formě 4 píků (koeluují n-humulon a adhumulon a dále n-lupulon a adlupulon), v UHPLC módu bylo dosaženo kompletní separace všech 6 analytů.

1 ÚVOD

Historicky nejdéle a v současnosti také nejčastěji analyzovanými složkami chmele jsou α-hořké kyseliny (dále α-kyseliny). Obsah těchto látek je základním parametrem (vedle jiných senzoricky aktivních látek) pro určení kvality chmele, neboť především jejich obsah určuje prodejní cenu chmele. Proto je analytickým metodám stanovení obsahu α-kyselin ve chmelu věnována velká pozornost. V průběhu posledního desetiletí byl zaznamenán přechod od méně specifických titračních metod k metodám více specifickým založeným na kapalinové chromatografii. Postup stanovení α- a β-hořkých kyselin (dále β-kyselin) kapalinovou chromatografií je od r. 1997 normalizován a je zakotven spolu s ostatními metodami užívanými ke zkoušení chmele v ČR v normě ČSN 46 2520 v části 17. Tato norma vesměs vychází z metod EBC nebo MEBAK. V kapalinové chromatografii lze stanovit vedle α- i β-kyseliny, které mají odlišný charakter od α-kyselin, a jejich vlastnosti a chování jsou v současné době předmětem výzkumu. V ČR v této oblasti úzce spolupracuje VÚPS, a.s. s Chmelařským institutem, s.r.o., a výsledky budou teprve publikovány.

Ve všech typech analýz je prvotním krokem extrakce α- a β-kyselin (měkkých pryskyřic) do nepolárního rozpouštědla. Titrační metoda využívala zpočátku extrakci do toluenu (Analytica-EBC, 2005a), ale později byl tento extrakční krok nahrazen extrakcí do diethyletheru v kyselém prostředí (Analytica-EBC, 2005b). Extrakt je titrován octanem olovnatým za vzniku komplexů s hořkými kyselinami, přičemž změna vodivosti systému je sledována konduktometricky. Obsah α-hořkých kyselin ve chmelu je vyjádřen v hmotnostních procentech hodnotou KH (konduktometrická hodnota). Tato hodnota zahrnuje obsah hořkých α-kyselin, ale v důsledku přítomnosti některých látek reagujících také s octanem olovnatým je tato reakce méně specifická a stanovená hodnota méně správná. Podíl β-kyselin je přibližně rozdíl celkového obsahu měkkých pryskyřic a hodnoty KH.

Etherický extrakt lze také po centrifugaci a naředění v methanolu analyzovat metodou HPLC. Chromatografická metoda umožňuje buď úplné, nebo částečné oddělení zón odpovídajících jednotlivým α-kyselinám, kohumulonu, n-humulonu a adhumulonu v závislosti na volbě kolony a mobilní fáze. Obdobně jsou oddělené zóny β-kyselin, kolupulon, n-lupulon a adlupulon. Na rozdíl od titračních metod jsou metody HPLC vysoce specifické a poskytují hodnoty odpovídající více reálnému stavu.

Je zřejmé, že správnost a přesnost stanovení obsahu α-kyselin ve chmelu a chmelovém extraktu zasahuje do obchodních vztahů. Je proto zájmem všech subjektů, ať pivovarů nebo pěstitelů a obchodníků, aby výsledky analytických laboratoří byly správné a srovnatelné. Jednotnost a správnost měření výsledků v metodách HPLC je zajištěna používáním jednotného mezinárodního kalibračního standardu, v současné době již třetího v pořadí, s označením ICE3. Evropské laboratoře se řídí metodami Evropské Pivovarské Konvence (Analytica-EBC, 1998) a pravidelně se mohou zúčastňovat mezinárodních srovnávacích testů pořádaných organizací MEBAK. VÚPS, a.s., se pravidelně zúčastňuje dvakrát ročně kontrolních testů organizovaných pod záštitou MEBAK a 6x ročně mezinárodních testů BAPS (Brewing Analytes Proficiency Testing Scheme) a metody určené pro zkoušení chmele jsou akreditovány u Českého institutu pro akreditaci, o.p.s. (ČIA).

EBC metody pro stanovení α- a β-kyselin jsou vypracovány pro dosud nejrozšířenější HPLC systémy. S rozvojem v instrumentaci v kapalinové chromatografii si své místo však nalézají i systémy UHPLC, neboť poskytují ve srovnání s klasickou HPLC nejen podstatné zkrácení doby analýzy a úsporu rozpouštědel, ale také výsledky s mnohem menší nejistotou a lepší opakovatelností (Olšovská et al., 2012b). Podrobné informace o této nové technice jsme uveřejnili v předchozích číslech tohoto periodika (Olšovská et al., 2012a, 2012b). Celkový čas analýzy obsahu hořkých kyselin ve chmelu může být dále ještě redukován efektivním extrakčním postupem tlakové extrakce vypracovaným na VÚPS (Čulík et al., 2009). Rychlý extrakční postup v kombinaci s moderní UHPLC technikou by laboratořím přinesl možnost velmi rychlého získávání dat a obchodní veřejnosti v chmelařské oblasti významné zvýšení jistoty správnosti údajů o obsahu α-kyselin.

2 MATERIÁL A METODY

Pro porovnání obou UHPLC a HPLC metod pro stanovení α- a β-kyselin byly použity vzorky chmele s obsahem α-kyselin v rozmezí 1,4–8,5 hm. %.

Vzorky byly extrahovány a upraveny pro analýzy dle postupu popsaného v metodě EBC 7.7 (Analytica – EBC, červen 2005). Pro kalibraci byl použit mezinárodní kalibrační standard ICE3 s celkovým obsahem α-kyselin 44,64 % hm. a β-kyselin 24,28 % hm. Kalibrační roztok byl připraven navážením 0,5 g ICE3 s přesností na 0,1 mg a rozpuštěním do 100 ml methanolu a následným desetinásobným zředěním methanolem čistoty pro gradient (Sigma Aldrich).

Chromatografické podmínky HPLC

α- a β-kyseliny byly analyzovány na chromatografické koloně s reverzní fází C18-Hop (250 x 4 mm, velikost částic 5 μm), Macherey Nagel, Německo. Separace probíhala v izokratickém režimu. Mobilní fáze byla tvořena 850 ml metanolu (pro HPLC, Sigma Aldrich), 190 ml vody (Millipore, čistota max. 5 ppb organických látek) a 5 ml kyseliny fosforečné (p.a., Merck). Teplota kolony byla udržována při 35 °C, průtok mobilní fáze byl 0,8 ml/min a nástřik vzorku na kolonu byl 5 μl. α- a β-kyseliny byly detekovány v UV oblasti podle Analytiky EBC při 314 nm.

K analýze byl použit kapalinový chromatograf SpectraSYSTEM (TSP, USA) s detektorem s diodovým polem (DAD). Sběr dat a vy hodnocení bylo provedeno chromatografickým softwarem ChromQuest pro Windows NT.

Chromatografické podmínky UHPLC

UHPLC analýzy byly provedeny na koloně BEH C18 (2,1 x 50 mm I.D, velikost částic 1,7 μm), Waters, teplota kolony byla 25 °C, průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min. Dvousložková mobilní fáze byla tvořena vodným roztokem TFA - voda (0,1:99,9, v/v) (A) a acetonitrilem (B). Separace analytů byla provedena gradientovou elucí z 50 % (B) do 80 % (B) za 6 min zakončenou 2 min ekvilibračním krokem. Nástřik vzorku na kolonu byl 2 μl. α- a β-kyseliny byly detekovány v UV oblasti při vlnové délce 314 nm.

UHPLC analýzy byly provedeny na kapalinovém chromatografu Acquity UPLCTM (Waters) s 2996 PDA detektorem operujícím v rozmezí vlnových délek od 194 do 600 nm. Data byla vyhodnocována softwarem Empower 2 (Waters).

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Na obr. 1 je uveden chromatogram HPLC analýzy podle metody EBC 7.7, kde α-kyseliny eluují ve dvou zónách (kohumolon v samostatné zóně a n-humulon s adhumulonem ve společné zóně). Obdobný profil elučních zón v obou systémech měly i β-kyseliny. Po optimalizaci metody UHPLC, kdy bylo použito zcela jiného typu kolony s částicemi menšími než 2 μm, neboli „sub-2- μm“, a o kterém jsme podrobněji psali v předchozích článcích (Olšovská et al., 2012a), bylo dosaženo v kombinaci se změnou mobilní fáze obsahující větší podíl polárnější složky úplné separace všech tří zón α- i β-kyselin (viz obr. 2). Běžně se v analytických pracích setkáváme s fenoménem mnohanásobné účinnosti UHPLC kolon oproti klasickým HPLC kolonám, ale většinou se jedná o zlepšení separace píků, které se i v klasickém módu alespoň částečně dělily. V případě dělení n-humulonu od adhumulonu (a stejně n-lupulonu od adlupulonu) se podařilo novou UHPLC metodou separovat dvě zóny, které v HPLC metodě nevykazovaly ani náznak dělení. Navíc došlo k významnému zkrácení doby analýzy α- a β-kyselin z 25 minut na 8 minut. To se odrazí ve vysoké průchodnosti vzorků laboratoří s podstatně sníženými náklady na spotřebu rozpouštědel. V UHPLC módu byla použita velice jednoduchá mobilní fáze, a to voda s přídavkem 0,1 % (v/v) TFA a acetonitril. Spotřeba této organické fáze vzhledem k rychlosti analýzy je minimální (asi 2 ml na jednu analýzu včetně ekvilibrace), což metodu výrazně zlevňuje. V případě HPLC je na jednu analýzu spotřebováno 17 ml organické fáze (methanolu).

Obr. 1 HPLC chromatogram extraktu chmele (odrůda Sládek) Chromatografické podmínky: Kolona C18-Hop (250 x 4 mm, velikost částic 5 μm), Macherey Nagel; teplota kolony 35 °C; průtok mobilní fáze 0,8 ml/min; mobilní fáze 850 ml methanolu, 190 ml vody a 5 ml kyseliny fosforečné; izokratická eluce; objem nástřiku 5 μl; UV detekce 314 nm

Obr. 2 UHPLC chromatogram extraktu chmele (odrůda Sládek) Chromatografické podmínky: Kolona BEH C18 (2.1 x 50 mm I.D, velikost částic 1.7 μm), Waters; teplota kolony 25 °C; průtok mobilní fáze 0,4 ml/min; mobilní fáze (A) TFA–voda (0.1:99.9, v/v), (B) acetonitril; gradientová eluce z 50% (B) do 80% (B) za 6 min, ekvilibrace 2 min; objem nástřiku 2 μl; UV detekce 314 nm

α-Kyseliny vykazují v UV spektru tři maxima 237, 285 a 322 nm (obr. 3). Podle metody EBC 7.7 je k detekci hořkých kyselin použita vlnová délka 314 nm. Dále tato metoda předepisuje jednobodovou kalibraci procházející počátkem. Za těchto podmínek byly vyhodnoceny obsahy α- a β-kyselin metodami HPLC a UHPLC v 11 vzorcích chmele. V tab. 1 je uveden přehled analyzovaných vzorků chmele společně s konduktometrickou hodnotou KH. V tab. 2 jsou uvedeny výsledky měření celkového obsahu α- a β-kyselin oběma srovnávanými metodami a rozdíl Δ mezi výsledky obou metod. V posledním sloupci je uvedena teoretická hodnota meze opakovatelnosti r95 vypočítaná pro jednotlivé hladiny (maximální povolený rozdíl mezi dvěma stanoveními v jedné laboratoři) vycházející z metodiky EBC, kap. 7.7. Hodnoty skutečného a teoretického rozdílu vycházejícího z opakovatelnosti metody byly spolu porovnány. Z tab. 2 je patrné, že v případě α-kyselin dává metoda UHPLC mírně vyšší výsledky (v průměru o 0,13 % hm.), avšak tyto rozdíly jsou pro všechny vzorky (kromě jednoho) nižší než povolená opakovatelnost. U β-kyselin jsou rozdíly kladné i záporné, avšak opět (kromě jednoho vzorku) pod teoretickou mezí opakovatelnosti. Lze tedy prohlásit, že obě metody jsou srovnatelné.

Obr. 3 UV spektrum kohumulonu parameters. Both hop samples were measured repetitively (n=8) UV spectrum bylo naměřeno pomocí UHPLC-DAD detektoru během separace α-kyselin za podmínek uvedených v části Materiál a metody. Ostatní α-kyseliny měly shodné UV spektrum s maximy 237, 285 a 322 nm

Tab. 1 Přehled testovaných vzorků chmele a jejich konduktometrická hodnota KH

Tab. 2 Srovnání obsahu α- a β-kyselin ve vybraných vzorcích chmele získaného metodou HPLC a UHPLC

Pro srovnání validačních parametrů HPLC a UHPLC metod na dvou koncentračních hladinách byly vybrány dva vzorky chmele (Sládek a ŽPČ) s rozdílnou hladinou α- a β-kyselin. Oba vzorky chmele byly změřeny opakovaně (n=8) a z naměřených dat byla vypočtena mez opakovatelnosti a odhad relativní nejistoty (k=2) pro α- i β-kyseliny. Odrůda Sládek (KH 10,18) obsahovala 8,57 ± 0,1 hm. % α- kyselin a 3,81 ± 0,04 hm. % β-kyselin. Odrůda Žatecký poloraný červeňák (KH 3,52) obsahovala 2,81 ± 0,03 hm. % α-kyselin a 5,57 ± 0,06 hm. % β- kyselin. Z tab. 3 je patrné, že meze opakovatelnosti i odhady nejistoty pro α- i β-kyseliny jsou v případě použití UHPLC metody významně nižší, ve všech případech až o jeden řád.

Tab. 3 Srovnání validačních charakteristik HPLC a UHPLC metody

4 ZÁVĚR

Tato studie uzavírá trojdílný seriál článků, které se zabývaly novou generací chromatografických kolon a s nimi spojenou instrumentací kapalinové chromatografie, rozšířenou pod názvem ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC). V prvním díle jsme představili tuto novou technologii a popsali její přínos v porovnání s klasickými metodami HPLC, který vyplývá ze základního principu této instrumentace a který se bezesporu pozitivně promítá do ekonomických nákladů na analýzu. Pro ověření tohoto tvrzení byly vypracovány dvě aplikační studie v oboru pivovarské analytiky.

Na příkladu stanovení iso-α-kyselin v pivu a dále na stanovení α- a β-kyselin ve chmelu bylo potvrzeno, že kromě ekonomických přínosů (úspora času a energií a rozpouštědel v důsledku významného zkrácení doby analýzy) poskytuje tato metoda měření s menším rozptylem výsledků. Metody pivovarské analytiky vycházejí z určitých konvencí, které zatím předpokládají použití starších typů HPLC přístrojů. Na základě obou studií lze však konstatovat, že použití UHPLC dává při zachování definovaných parametrů měření (způsob detekce, kalibrace a kvantifikace) srovnatelné výsledky s metodou HPLC, a proto lze používat oba typy instrumentálních technik, aniž by byla ohrožena správnost výsledků.