Milan Popl (Počátky a historie ČS HPLC)

Narozený 10. 3. 1934 v Čáslavi, absolvoval VŠCHT v Praze na Katedře syntetických paliv a ropy v r. 1964, na téže katedře, teď již pod jménem Katedra technologie ropy a petrochemie, obhájil kandidátskou disertaci v r. 1969 a v r. 1974 obhájil doktorskou disertační práci na téma Separace aromatických uhlovodíků na alumině. V r. 1976 přešel jako docent na Katedru analytické chemie VŠCHT, kde vedl skupinu separačních metod až do r. 2000, kdy odešel do důchodu. Jako spoluautor skript Instrumentální analýza, Základy chromatografie a Analytická chemie životního prostředí má výrazný podíl na zavedení chromatografie do výuky analytické chemie a do laboratorních cvičení.

JAK JSME ZAČÍNALI S KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ NA VŠCHT

Stručně lze říci, že za šedesát let po Cvětově experimentu (v r. 1903) se v kapalinové chromatografii mnoho nezměnilo. Taková byla přibližně situace na Katedře syntetických paliv a ropy, Vysoké školy chemicko‐technologické v Praze, kam jsem v r. 1964 nastoupil jako vědecký aspirant.

Používal se otevřený systém adsorpční chromatografie s polárním sorbentem a nepolárním eluentem, někdy také označovaný jako systém s normálními fázemi (NP‐LC), na rozdíl od systému s obrácenými fázemi (RP‐LC), který vznikl později, a který v současnosti převládá. Kolony byly většinou skleněné trubice o vnitřním průměru asi 10 mm a délky 1 m, které měly nahoře natavenou skleněnou baňku, jako zásobník eluentu. Dole byly zakončeny zúžením, ve kterém byl smotek skelné vaty, nebo frita, popř. byly zakončeny skleněným kohoutem. Ukázky kolon jsou na Obr. 1. Plnily se nejčastěji aluminou nebo silikagelem a k dosažení kompaktnosti náplně se po stěnách trubice přejíždělo vibrátorem. Vzorek se vnesl do kolony injekční stříkačkou, několik mm pod vrstvu sorbentu a potom se opatrně nalil eluent, aby nedošlo k rozvíření sorbentu. Jako eluenty se používaly níževroucí uhlovodíky, např. pentan, hexan, z jiných pak diethylether. Na výstupu z kolony se potom odebíraly vzorky, které se analyzovaly většinou spektrálně. Eluce probíhala velmi pomalu, pouze na základě gravitace, často několik hodin. Proto se postupy vylepšovaly, nejprve umístěním eluentu vysoko nad kolonou, později použitím přetlaku inertního plynu nad hladinu eluentu.

ČSHS: Obr. 1: Kolony pro otevřený systém a hliníkové lahve s aluminou

Příkladem takového postupu byla metoda FIA, (Fluorescent Indicator Adsorption, ASTM method D 1319‐66T), která dovolovala v nižších ropných frakcích stanovit tři skupiny uhlovodíků. Do suchého silikagelu se vnesl vzorek a potom se prostor nad silikagelem naplnil isopropanolem. Ten před sebou tlačil všechny složky vzorku, šlo tedy o tzv. vytěsňovací chromatografii. K urychlení analýzy se používal přetlak dusíku. Do vzorku se přidával speciální indikátor a separované zóny složek, které postoupily do spodní části, tzv. analyzátoru, ve světle o vlnové délce 365 nm vykazovaly různá zbarvení fluorescence. Vyhodnocování bylo jednoduché, měřily se délky zóny centimetrem. Tato metoda byla používána ještě v r. 1975, možná i později.

ČSHS: Obr. 2: Silnostěnná skleněná kolona s nástřikovou hlavou

Mezi méně známé techniky patří frontální chromatografie, kdy eluentem je vlastní vzorek. Tuto techniku jsme použili v r. 1974 pro zkoncentrování aromátů z bílých olejů a dearomatizovaných nalkanů. Vzorek byl čerpán přes kolonu naplněnou silikagelem, nasycené uhlovodíky nebyly zadržovány a aromáty se zachytily.

Také, i když v menší míře, se používaly velké kolony o průměru 10 a více cm, s délkou několika metrů, které často musely být umístěny do technologických hal s vysokým stropem. Tyto kolony se používaly k izolaci látek ze syntézy nebo z extraktů přírodních látek. Tady trvala celá operace řadu hodin a nebylo žádnou výjimkou, že se u experimentu muselo přespávat a v pravidelných intervalech odebírat vzorky.

Tato kniha vznikla za vzájemné spolupráce České společnosti pro hmotnostní spektrometrii, české pobočky firmy Thermo Fisher Scientific a firmy Pragolab. Vydání bylo realizováno za sponzorského přispění firem Thermo Fisher Scientific a Pragolab.

ČSHS: Česká společnost pro hmotnostní spektrometrii, česká pobočka firmy Thermo Fisher Scientific, firma Pragolab.

Významným impulzem k rozvoji kapalinové chromatografie byla kniha L. R. Snydera Principles of Adsorption Chromatography (Marcel Dekker Inc. New York, 1968), kde se pokusil o teorii vzájemných vztahů mezi sorbentem, eluentem a analytem. Jeho práce, i když byla časem překonána, přinesla řadu poznatků o elučních datech polycyklických aromátů a některých heterocyklických látek, převážně na alumině a v menší míře i na silikagelu. Publikoval celou řadu rozpouštědel seřazených podle eluční síly, eluotropickou sérii, a zabýval se vlivem planarity molekuly analytu na jeho eluční objem. V r. 1969, po obhájení kandidátské disertace, jsem byl přijat jako vědecký pracovník na Katedru technologie ropy a petrochemie, jak zněl nový název dřívější Katedry syntetických paliv. V té době ještě nebyly dostupné chemicky vázané stacionární fáze, a tak naprostá většina experimentů probíhala technikou adsorpční chromatografie. Zaměřili jsme se na separaci aromatických uhlovodíků a na rozpracování některých Snyderových poznatků o planární adsorpci na alumině.

Důležité bylo hodnocení účinnosti kolon a stanovení faktorů, které účinnost ovlivňují. Byla využita van Deemterova rovnice, původně v r. 1956 vytvořena pro plynovou chromatografii, a byla Giddingsem úspěšně aplikována na chromatografii kapalinovou. Podstatný je rozdíl v molekulární difúzi v mobilní fázi, která je v kapalině řádově pomalejší než v plynu. Z toho potom vyplynul vliv velikosti částic sorbentu, které musejí být co nejmenší, aby se zkrátila dráha analytu z mobilní fáze k povrchu sorbentu. Výškový ekvivalent teoretického patra H je do značné míry závislý na velikosti částic sorbentu a mírně stoupá s rostoucí lineární rychlostí mobilní fáze u. Na rozdíl od plynové chromatografie závislost H vs. u má pro kapalinovou chromatografii minimum až při tak nízkých průtocích mobilní fáze, které nemají praktické využití. Tak tomu alespoň bylo až do nástupu vysokotlaké resp. vysokoúčinné kapalinové chromatografie.

ČSHS: Obr. 3: Programátor gradientu firmy LKB Producter s papíry pro kreslení programu, s ventily a peristaltickým čerpadlem

Podrobněji jsme se zabývali problémem účinnosti obsáhlejší studií v r. 1975. Z dostupných adsorbentů (aluminy a silikagelu) jsme sítovou analýzou připravili frakce o různém rozměru zrn od 30 do 220 μm, použili jsme silnostěnné skleněné kolony o vnitřním průměru 2, 3 a 4 mm a teplotu od 20 do 60 °C. Při testování různých lineárních rychlostí a velikosti nástřiku výsledky vyzněly jednoznačně ve prospěch silikagelu. Bylo dosaženo výšky teoretického patra pod 1 mm při přijatelné lineární rychlosti. Teoretické základy rozdělovací (partiční, kapalina – kapalina, LLC) chromatografie vycházely ze známých poznatků v extrakci. V principu je možno tuto techniku hodnotit jako distribuci analytu mezi dvě nemísitelné fáze. Pokusy o zavedení LLC byly většinou neúspěšné, pokud byla stacionární fáze mechanicky nanesena na inertním nosiči. Obě kapalné fáze by měly být nemísitelné, měly by se lišit polaritou a měly by vyhovovat použitému detektoru. Problém spočíval v tom, že neexistovaly dvě kapaliny, které by byly zcela nemísitelné. Pokud se na tuhý sorbent nanesla kapalná stacionární fáze, docházelo k jejímu rozpouštění eluentem. Používaným řešením bylo nasycení eluentu saturační předkolonkou, která obsahovala hrubý nosič s několika desítkami procent stacionární fáze. Tak byl např. použit Carbowax 400 s pentanem a skvalen se směsí voda – acetonitril jako mobilní fází. Často přitom docházelo k zalepování detektoru vymývanou stacionární fází.

Řešením problému LLC se staly chemicky vázané stacionární fáze. Základem těchto fází je silikagel. Nejprve byl použit ve formě porézních částic nepravidelného tvaru a hydroxylové skupiny silikagelu byly esterifikovány různými alkoholy. Tento typ sorbentu měl malou odolnost proti hydrolýze nebo případné reesterifikaci. Podstatný úspěch zaznamenaly stacionární fáze připravené reakcí silikagelu s oktadecyltrichlorsilanem v nepolárním rozpouštědle. Dalším zlepšením byly kulovité částice silikagelu, ať už plně porézní nebo s neporézním jádrem, na jejichž povrchu byla vytvořena vrstvička chemicky vázaného silikonového polymeru. Náplně s oktadecylovými skupinami jsou nepolární a používají se ve spojení s polárními eluenty, jako jsou metanol – voda, acetonitril – voda apod., tedy pravý opak kapalinové adsorpční chromatografie. Proto se pro tento systém začal používat název kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi (RP‐LC).

ČSHS: Obr. 4: UV detektor 254 nm firmy Waters Ass.

Alternativu k chemicky vázaným stacionárním fázím představují polymerní sorbenty. Řada polymerních sorbentů připravených Ing. Jiřím Čoupkem, CSc. na Ústavu makromolekulární chemie ČSAV byla na našem pracovišti testována jako sorbent pro analytické separace i pro záchyt různých typů analytů z vody a ovzduší. Na tomto místě je třeba ocenit mimořádný přínos zemřelého Ing. Čoupka k rozvoji kapalinové chromatografie v Československu, a to jak na vývoji polymerních sorbentů v ÚMCH, tak i později v n. p. Laboratorní přístroje, kde se podílel na výzkumu a vývoji.

Získané poznatky byly potom využity v pedagogice, když jsem jako docent nastoupil v r. 1976 na Katedru analytické chemie. Společně s Ing. Jaroslavem Kubátem jsme napsali v r. 1978 skriptum Základy chromatografie, které potom bylo využíváno na několika katedrách VŠCHT a dočkalo se i dalších vydání, naposledy pod názvem Separace látek vyšlo v r. 1986. Vedle teoretických základů tam byla popsána tehdejší technika, jak v plynové, tak i kapalinové chromatografii.

Při mém nástupu na Katedru analytické chemie v r. 1976 byla chromatografie zcela na okraji zájmu, protože katedra byla orientována na elektrochemii a spektrální metody. Kapalinová chromatografie byla také postupně zaváděna do základních laboratoří k předmětu Analytická chemie. Nejprve v roce 1977 byla modifikována úloha z fluorimetrie na dvou pracovištích tak, že fluorimetrickému stanovení předcházela separace fluorescenčního barviva na koloně plněné polymerním sorbentem. Již v následujícím roce byla separována modelová směs dvou aromatických látek, které pak byly identifikovány a stanoveny absorpční spektrometrií na spektrometru Specord. Od roku 1979, kdy byly získány další dva fotometrické detektory z Vývojových dílen ČSAV, tato práce probíhala na čtyřech pracovištích s komerčními kolonami plněnými sorbentem Separon SE. V druhé polovině 80. let bylo vybaveno šest pracovišť lineárními dávkovači, fotometrickými detektory, nástřikovými ventily a skleněnými kolonami typu CGC se sorbentem na bázi silikagelu z produkce n. p. Laboratorní přístroje Praha. V první polovině devadesátých let byl záznam chromatogramů na zapisovači nahrazen počítačovou chromatografickou stanicí fy Apex.

Dlouhá doba experimentu v otevřeném systému vedla k tomu, že se hledaly cesty, jak chromatografický proces urychlit. Začal se používat systém uzavřený v tomto uspořádání: zásobník eluentu – čerpadlo – nástřikové zařízení ‐ kolona – detektor a postupně se jednotlivé prvky zlepšovaly.

ČERPADLA

Jako první se na VŠCHT objevila jednoduchá malá pístová, popř. plunžrová, čerpadla MC 300, která vyráběl podnik Mikrotechna Modřany, a která byla použitelná do tlaků v jednotkách MPa. Průtok byl regulován změnou zdvihu pístu. Vedle některých potíží s jejich těsněním byl největším problémem pulzující tok, který nesvědčil ani koloně ani detektoru. V dílnách na VŠCHT byla tato čerpadla přestavována na zdvojená, kdy se obě čerpadla v maximech střídala. Tím se dosáhlo určitého zlepšení, kdy pulzace klesla asi na polovinu, ale rovnoměrného toku se nedosáhlo. Dalším vylepšením potom byly tlumiče pulzů. Za výstup z čerpadla se zařadila kapacita, často skleněná banička nebo nerezový vlnovec, kde pulzace tlumil vzduchový polštář. Tento systém byl použitelný pouze v těch případech, kdy se pracovalo pouze s jedním eluentem. Při použití postupného zvyšován eluční síly, při gradientové eluci, byla kapalina zadržená v tlumiči pulzů na závadu.

Řešením plynulého dávkování mobilní fáze byly lineární dávkovače. V podstatě šlo o vertikální injekční stříkačku 200‐500 ml zhotovenou z nerezu. Její píst byl poháněn krokovým motorem, kde rychlost posunu bylo možno libovolně naprogramovat. Na VŠCHT se toto zařízení objevilo kolem roku 1970, velmi brzy potom, co se lineární dávkovač firmy ISCO Dialagrad Modell 190 objevil na trhu, a to díky manažerským schopnostem prof. Jiřího Mosteckého, který dokázal zajistit potřebné devizy. O několik let později, v mnohem robustnějším provedení, se začaly tyto dávkovače vyrábět v n. p. Laboratorní přístroje Praha. Výhodou lineárních dávkovačů byl jednoznačně bezpulzní tok a schopnost pracovat při tlaku v desítkách MPa. Lineární dávkovače se dodávaly ve dvojicích a tak umožňovaly i gradientovou eluci. Nevýhodou byla nutnost přerušení práce, když píst dosáhne horní úvratě a pracné vyplachování při změně eluentu. Další nevýhodou byla jejich hmotnost, kdy přemístění těchto dávkovačů vyžadovalo skutečně silného muže.

Lineární dávkovače byly oblíbené a udržely se v provozu řadu let, ale jejich užití se omezilo, když se podařilo vyřešit systém několika, nejčastěji dvou, pístových čerpadel s programovaným pohybem pístů.

KOLONY

Pro uzavřený systém kolony navazovaly na dříve používaná zařízení. Na počátku jsme pracovali s kolonami firmy Nester Faust, které byly skleněné, silnostěnné, měly délku 0,5 ‐ 1 m a vnitřní průměr 3 nebo 4 mm. Na vstupu i na výstupu byly teflonové koncovky, kde vstup byl opatřen septem, které umožňovalo nástřik vzorku injekční stříkačkou. Výstup obsahoval teflonovou fritu. Propojení s čerpadlem a detektorem zajišťovaly teflonové hadičky. Tato kolona je na Obr. 2. Plnění těchto kolon bylo stejné jako u dříve používaného otevřeného systému, tj. do kolony se nasypal suchý sorbent a přejížděním vibrátoru po koloně se docílilo kompaktnosti náplně. Podobně byly konstruovány větší kolony pro preparaci, které měly délku 1 m a vnitřní průměr 10 mm. Kolona obsahovala 75 g aluminy a eluované složky byly zaznamenány argonovým ionizačním detektorem.

Plnění kolony suspenzní technikou jsme poprvé použili v r. 1976, kdy jsme do kolony o světlosti 2,2 mm plnili suspenzi silikagelu o velikosti částic 11 μm ve směsi bromoform – tetrachlormetan.

Kolony pro gelovou permeační chromatografii (GPC) byly podstatně objemnější. V jednom případě to byla série dvou kolon, každá 150 cm dlouhá o vnitřním průměru 1,3 cm, v dalším to byla série 5 nerezových kolon 120 x 0,8 cm, s gelem o vylučovacím limitu 1.000 daltonů, které jsme použili pro porovnání retenčních dat alkylbenzenů v r. 1975.

Při práci s kolonami se sypanou náplní bylo pozorováno, že mobilní fáze u stěny kolony postupuje rychleji než v jejím středu. Tím docházelo k rozšíření zóny analytu a ke snížení účinnosti kolony. Proto byl učiněn pokus s kolonou o „nekonečném průměru“. Šlo o krátkou kolonu, která měla velký průměr několika centimetrů. Vzorek se vnesl v malém objemu na začátek kolony a během postupu kolonou se nesměl dotknout stěn. Potřeba velkého množství sorbentu a eluentu tento pokus odsoudily k neúspěchu.

ADSORBENTY

Mezi oblíbené adsorbenty v letech kolem r. 1970 patřila alumina. Používaly se nepravidelné částice o velikosti 0,12 – 0,15 mm, kterými se plnily kolony za sucha. Alumina se aktivovala žíháním na 400 °C po dobu asi 8 h a potom se její aktivita upravovala přidáním určitého množství vody. Význačným znakem aluminy je její bazicita. Kyselejší látky se na alumině dělit nedaly, protože docházelo k chemisorpci. Jako varianty se objevily bazická alumina, a kyselá alumina, ale příliš se neujaly, a tak jako nejběžnější zůstala alumina označovaná neutrální. Různé druhy aluminy se dodávaly v hliníkových lahvích, které jsou na Obr. 1. Alumina má menší kapacitu než silikagel a také menší mechanickou pevnost. Později, při používání vyšších tlaků, byla alumina pro malou mechanickou pevnost opouštěna. Řešení nanesením aluminy ve vrstvičce na pevné neporézní jádro se příliš neujalo.

Silikagel se aktivoval zahříváním na 180 °C po dobu tří hodin. Potom se jeho aktivita upravovala přídavkem vody. Používal se typ s velkými póry, který měl podstatně větší kapacitu než alumina, tj. snesl dávkování většího vzorku. Hydroxylové skupiny na povrchu silikagelu se vyznačují kyselostí, která způsobovala silnou retardaci např. dusíkatých bází. Silikagel se vyznačoval dobrou mechanickou pevností a snášel tlaky v řádu desítek MPa. Postupně, jak se přecházelo na stále menší částice adsorbentu, silikagel zcela převládl.

Vedle těchto dvou nejužívanějších sorbentů se ještě v malé míře používal Florisil, v podstatě křemičitan hořečnatý, jehož vlastnosti se nacházely někde uprostřed mezi silikagelem a aluminou.

Ve spolupráci s Ing. Jiřím Čoupkem z Ústavu makromolekulární chemie (ÚMCH) ČSAV jsme začali první práce v GPC, a to na styren ‐ divinylbenzenových gelech (obsah 8 % divinylbenzenu), které jsme nejprve využívali k předběžnému oddělení polyaromátů ze složitých vzorků. V r. 1974, ve spolupráci s pracovníky ÚMCH, jsme na tomto gelu, pod označením S‐gel 832, publikovali retenční data pro alkyl benzeny.

ELUENTY

Pro aluminu, podobně jako pro silikagel, byl většinou používán pentan, hexan, methylcyklopentan apod. V případě gradientové eluce na alumině jako adsorbentu byl pentan jako eluent doplněn diethyletherem. Tato sestava přinášela někdy těžkosti, kdy v horkém létě dosahovala teplota v místnosti kolem 30 °C a pentan tvořil bubliny v pístovém čerpadle, v potrubí a někdy trhal sloupec sorbentu. Klimatizace laboratoře byla v té době věcí neznámou. Pro stanovení polycyklických aromátů v dehtech jsme použili gradient cyklopentan – diethylether, pro separaci dusíkatých heterocyklických sloučenin jsme použili směs pentanu s 10 % dichlormethanu. Při separaci montánních vosků na silikagelu jsme použili razantnější eluenty: gradienty isooktan – ethylacetát nebo ethylacetát – isopropanol. K tvorbě vhodného gradientu, v tomto případě, byl k dispozici Ultrograd švédské firmy LKB Producter (Obr. 3, který umožňoval předem připravit libovolný průběh gradientu. Tento přístroj byl zajímavý tím, že průběh gradientu se nakreslil na tuhý papír, vystřihl a umístil na přední prosklenou stěnu přístroje. Pohybující se fotobuňka za prosklenou stěnou potom řídila průběh gradientu. Používané průtoky mobilní fáze pro skleněné kolony světlosti 3 – 4 mm se pohybovaly mezi 40 ‐ 70 ml/h. Pro gelovou chromatografii byl převážně používán jako mobilní fáze tetrahydrofuran, méně často benzen.

DETEKTORY

První detektory byly založeny na absorpci ultrafialového záření, což vyhovovalo našemu zaměření na polycyklické aromáty a heterocykly. Speciální detektory pro LC zatím nebyly, proto jsme v r. 1970 vyžívali průtočné cely umístěné v UV‐vis spektrometru Pye Unicam SP 800B. Cely měly optickou délku od 1 do 10 mm a mrtvý objem 0,2 ‐ 0,64 ml. Větší mrtvý objem snižoval účinnost separace, ale spektrofotometr ve spojení s tříbodovým zapisovačem umožňoval záznam eluovaných látek při třech vlnových délkách 260, 275 a 296 nm. Postup vyžadoval v 30 vteřinových intervalech přestavovat ručně vlnovou délku, ale přinášel do analýzy dobrou selektivitu. Pracnost postupu při analýze, která trvala 140 min (eluce koronenu) je zřejmá.

Vývoj šel rychle kupředu, a tak v r. 1973 jsme začali užívat diferenciální UV detektor firmy Waters Ass. pracující s jedinou vlnovou délkou 254 nm, ale s optickou délkou 1 cm a mrtvým objemem 8 μl. Tento detektor, na Obr. 4, již nepřinášel do systému další snížení účinnosti.

UV detektory československé výroby jsme dostali kolem r. 1977. Byl to výrobek Vývojových dílen ČSAV v Praze (Obr. 5), který pracoval s měnitelnou vlnovou délkou 200 – 400 nm.

ČSHS: Obr. 5: UV detektor s proměnnou vlnovou délkou z Vývojových dílen ČSAV

Většina polycyklických aromátů se vyznačuje charakteristickou fluorescencí, proto byl v r. 1974 využit spektrofluorimetr Aminco‐Bowman (Obr. 6) s průtočnou celou o průměru 0,3 cm. Při excitaci 377 nm a emisi 403 nm se podařilo spolehlivě stanovit obsah benzo(a)pyrenu v černouhelném dehtu a v pyrolýzní pryskyřici. V dalším vývoji se objevily fluorescenční detektory, které měly průtokovou celu o objemu 20 μl, na excitaci sadu interferenčních filtrů a mřížkový monochromátor na emisní straně. Doplňkem bylo zařízení, které umožňovalo zastavit na krátkou dobu průtok mobilní fáze a zaznamenat fluorescenční spektrum.

ČSHS: Obr. 6: Spektrofluorimetr Aminco‐Bowman

Vzhledem k tomu, že ne všechny látky absorbují dostatečně UV záření, objevil se na trhu detektor, který měl být univerzální. Byl to argonový ionizační detektor W. G. Pye Liquid Chromatograph Modell 1., který se objevil na Katedře technologie ropy a petrochemie v r. 1970, opět zásluhou prof. Mosteckého. V postatě to byl transportní detektor, kde eluát smáčel pohybující se nerezový drátek. Část eluátu, která ulpěla na drátku, byla unášena nejprve do odpařovací části, kde se odpařil eluent, a potom do další části, kde v proudu argonu docházelo k pyrolýze analytu. Produkty pyrolýzy byly unášeny do argonového ionizačního detektoru. Detektor vyžadoval velký rozdíl v bodech varu eluentu a analytu a opakované použití cívky nerezového drátku bylo problematické. Tento detektor jsme užívali většinou ve spojení s preparativními kolonami. Malá citlivost a poruchovost pohyblivých částí způsobily, že tento detektor brzy skončil.

Poměrně brzy se začal používat diferenciální refraktometr. První naše použití tohoto detektoru v r. 1972 souviselo s GPC, kdy byly odděleny vysokomolekulární složky pyrolýzního oleje od polycyklických aromátů. Tato preparativní separace byla zaznamenávána detektorem fy Waters Ass. Modell R‐400. Refraktometrické detektory musely být temperovány a podle indexu lomu analytu v porovnání s indexem lomu mobilní fáze byly píky zaznamenávány nahoru nebo dolů od nulové linie. Pokud se indexy shodly, nebyla eluující složka zaznamenána. Negativní píky se objevovaly zejména při použití benzenu jako eluentu. Menší citlivost RI detektoru byla vhodná právě pro preparativní separace.

KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE S OBRÁCENÝMI FÁZEMI

Tato technika začala u nás na VŠCHT trochu jinak, než bylo v té době ve světě běžné. Opět ve spolupráci s Ing. Čoupkem, tentokráte již jako vedoucím pracovníkem Výzkumného a vývojového pracoviště n. p. Laboratorní přístroje, jsme použili dva hydrofobní gely, a to: Spheron SE jako kopolymer styrenu a etylendimethakrylátu, s velikostí sférických částic kolem 20 μm a vylučovacím limitem 40.000 u. Kolona 50 x 0,3 cm byla plněna ve vodné suspenzi a při separaci polyaromátu eluována gradientem voda – metanol ‐ diethylether. Zajímavé bylo, že tento sorbent separoval uhlovodíky podle počtu uhlíků, bez ohledu na to, zda jde o aromatický nebo alifatický uhlík.

Druhým gelem byl Spheron 40 S, který měl analogickou strukturu jako předchozí materiál, na vnitřní povrch pórů byl vázán rovný uhlíkový řetězec C18. Oba materiály snášely tlak kolem 10 MPa a rozpouštědla od vody přes alkoholy, ethery až po nasycené uhlovodíky bez toho, že by docházelo k objemovým změnám. Oba gely byly použity jak pro kapalinovou chromatografii, tak i pro záchyt některých kontaminantů, např. fenolů, z vody.

Asi o deset let později jsme použili kapalinovou chromatografii s obrácenými fázemi při studiu chování volných bází a protonizovaných forem alkaloidů a část těchto poznatků jsme popsali v knize M. Popl, J. Fähnrich a V. Tatar: Chromatographic Analysis of Alkaloids (Marcel Dekker Inc. New York, 1990), ale to už je zcela jiná historie.

Na závěr mimořádný dík patří prom. fyz. Janu Fähnrichovi, CSc., který se podílel na většině prací při uvedeném vývoji kapalinové chromatografie a dále za pečlivé přečtení a korekce a za doplnění informací o posluchačských laboratořích. Jmenovaný je též autorem fotografií uvedených v tomto příspěvku.