Amyloid Beta Peptides Quantification by SPE-LC-MS/MS with Automated Sample Preparation for Preclinical Research and Biomarker Discovery

Význam tématu

Quantifikace amyloid-β (aβ) peptidů v mozkomíšním moku (CSF) hraje klíčovou roli ve výzkumu a diagnostice Alzheimerovy choroby. Přesné stanovení koncentrací jednotlivých isoform (1–38, 1–40, 1–42) přispívá k identifikaci biomarkerů, podpoře předklinického vývoje léčiv a sledování průběhu onemocnění.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie představuje optimalizaci robustní, vysoce průchodné metody SPE-LC-MS/MS s plně automatizovanou přípravou vzorků pro kvantifikaci aβ peptidů v lidském CSF. Cílem bylo dosáhnout nízkých mezí kvantifikace (0,1 ng/mL) při minimálním objemu vzorku (100 µL), splnit FDA doporučení pro bioanalytickou validaci a demonstrovat automatizační kompatibilitu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky CSF byly předčištěny a stabilizovány umělým CSF s 4 g/L BSA (alternativa k 5 % potkaní plazmě), doplněny 15N značenými vnitřními standardy a podrobeny denaturaci guanidinem a kyselinou fosforečnou. Extrakce probíhala pomocí Oasis PRiME MCX µElution destiček za automatizace na platformě Tecan Freedom EVO 100/4.

• UPLC: ACQUITY UPLC I-Class Fixed Loop System s Peptide BEH C18 (300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 150 mm, 55 °C).
• MS/MS: Xevo TQ-S micro s ESI+, sledování MRM přechodů pro aβ 1–38, 1–40, 1–42.
• Softwarové řízení a vyhodnocení: MassLynx a TargetLynx.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LLOQ 0,1 ng/mL pro všechny tři isoformy z objemu 100 µL CSF. Recoveries QC vzorků byly v rozmezí 86–101 %, přesnost 95–100 %, preciznost (CV) ≤10 %. Chromatografická optimalizace (pevné ukončení gradientu, úprava mycích roztoků) eliminovala carry-over i s až 800 injekcemi a zajistila stabilitu vzorků v autosampleru 5 dní. Přechod z potkaní plazmy na BSA pro eliminaci nespecifického vázání prokázal srovnatelnou účinnost.
Automatizované zpracování pomocí Tecan ukázalo srovnatelnou výkonnost s manuální přípravou (p < 0,05) bez snížení recovery.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlý workflow (<90 min pro 96 vzorků), nízké náklady na spotřební materiál, vysoká průchodnost a úplná automatizace snižují provozní variabilitu. Metoda je vhodná pro rutinní kvantitativní analýzu biomarkerů v rámci předklinických i klinických studií.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu biomarkerů o další peptidy a proteiny spojené s neurodegenerací.
• Integrace s multiplexními platformami a digitálními řešeními pro vysoce propustné laboratorní workflow.
• Další miniaturizace objemu a zvýšení citlivosti pomocí pokročilých MS systémů.
• Nasazení validovaných metod v klinických laboratořích a podpora personalizované medicíny.

Závěr

Optimalizovaná SPE-LC-MS/MS metoda s Oasis PRiME MCX destičkami a Xevo TQ-S micro MS splňuje požadavky na citlivost, robustnost a automatizaci při kvantifikaci aβ peptidů v CSF. Výsledky podporují její využitelnost v preklinickém výzkumu, objevování biomarkerů i přípravě klinických testů.

Reference

1. Oe T. et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006, 20, 3723–3735.
2. Ford MJ. et al. J. Neurosci. Methods 2008, 168, 465–474.
3. Pannee J. et al. Alzheimer’s Dementia 2016, 12, 55–59.
4. Lame EM., Chambers EE. Waters Application Note 720003682EN, 2010.
5. Chambers EE., Lame ME., Diehl DM. Waters Application Note 720003860EN, 2011.
6. FDA Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, 2013.
7. EU Certification Report ERM-DA480k (aβ 1–42 CRM).