LC-MS/MS Analysis of Amyloid Beta Peptides in Artificial Cerebrospinal Fluid Using the Xevo™ TQ Absolute Mass Spectrometer for Clinical Research

Význam tématu

Amyloid-beta peptidy jsou klíčovými biomarkery neurodegenerativních onemocnění, zejména Alzheimerovy choroby. Jejich hladiny v mozkomíšním moku úzce korelují se vznikem a progresí amyloidových plaků v mozku. Tradiční imunologické metody, jako ELISA, mohou trpět zkříženou reaktivitou, variabilitou mezi šaržemi a nutností samostatného testu pro každé isoformy, což zvyšuje časovou náročnost a náklady. V tomto kontextu nabízí LC-MS/MS vysoce selektivní a multiplexní přístup k simultánnímu stanovení více isoform peptidů z jednoho vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit schopnost systému ACQUITY Premier UPLC I-Class spárovaného s Xevo TQ Absolute Mass Spectrometer pro kvantitativní analýzu tří hlavních isoform amyloid-beta peptidů (Aβ1–38, Aβ1–40, Aβ1–42) v umělém mozkomíšním moku (aCSF) v rozsahu koncentrací 0,1–10 ng/mL. Studie demonstruje citlivost, linearitu, přesnost a opakovatelnost navržené metody pro použití ve výzkumu klinických farmakodynamických studií.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byly do 200 μL aCSF obsahujícího 0,4 % (m/v) BSA přidány kalibrační a QC standardy a interní standard. Následovalo denaturace guanidinem-HCl, srážení kyselinou fosforečnou, SPE extrakce na Oasis MCX μElution destičce, sušení dusíkem a rekonstituce v 20:80:1 acetonitril:voda:amoniak.

• Chromatografie:
  Column: ACQUITY UPLC BEH Peptide C18 300 Å, 2,1 × 150 mm, 1,7 μm
  Gradient: 10–55 % organické fáze (acetonitril/0,3 % NH4OH) během analýzy
• Hmotnostní spektrometrie:
  Xevo TQ Absolute Mass Spectrometer v režimu MRM s definovanými přechody pro Aβ1–38, Aβ1–40, Aβ1–42 a jejich interní standardy

Hlavní výsledky a diskuse

Navržená metoda prokázala vysokou analytickou kvalitu:

• Sensitivita: poměr signál/šum > 10:1 pro všechny tři isoformy při 0,1 ng/mL.
• Linearita: kalibrační křivky s r2 > 0,999 při 0,1–10 ng/mL v pěti analýzách.
• Preciznost: celková preciznost a opakovatelnost < 5 % CV pro QC vzorky na úrovních 0,2, 1,0 a 7,5 ng/mL.
• Přesnost: napěťová odchylka 96,1–100,4 % nominálních hodnot.

Výsledky ukazují, že kombinace selektivní přípravy vzorku, optimalizované chromatografie a MRM detekce poskytuje spolehlivou kvantifikaci Aβ peptidů v surrogate matrici.

Přínosy a praktické využití metody

Multiplexní stanovení všech tří klíčových isoform v jednom běhu šetří čas a materiál, zvyšuje reprodukovatelnost a minimalizuje chyby způsobené křížovou reaktivitou. Metoda je vhodná pro preklinické i klinické výzkumné studie farmakodynamiky nových léčiv, screening biomarkerů a validaci terapeutických postupů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření aplikace na další neurodegenerativní biomarkery a propojování s proteomickými platformami může zvýšit hloubku a šíři dat. Automatičtější příprava vzorků a integrace s datovou analýzou založenou na strojovém učení slibují další zrychlení a zefektivnění workflow.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda na bázi ACQUITY Premier UPLC I-Class a Xevo TQ Absolute Mass Spectrometer poskytuje vynikající citlivost, linearitu, přesnost a preciznost pro kvantifikaci Aβ1–38, Aβ1–40 a Aβ1–42 v umělém mozkomíšním moku. Tím vytváří robustní základnu pro výzkum a vývoj nových terapeutik cílených na Alzheimerovu chorobu.

Reference

1. Jensen M, Hartmann T, Engvall B, Wang R, Uljon SN, Sennvik K, et al. Quantification of Alzheimer Amyloid Beta Peptides Ending at Residues 40 and 42 by Novel ELISA Systems. Mol Med. 2000;6(4):291–302.
2. Lachno DR, Evert BA, Maloney K, Willis BA, Talbot JA, Vandijck M, Dean RA. Validation and Clinical Utility of ELISA Methods for Quantification of Amyloid-beta Peptides in Cerebrospinal Fluid Specimens from Alzheimer’s Disease Studies. J Alzheimers Dis. 2015;45(2):527–542.
3. Salcedo J, Ph. L, Davey L, Lame M, Dunning C, Chambers E. Amyloid Beta Peptides Quantification by SPE-LC-MS/MS With Automated Sample Preparation for Preclinical Research and Biomarker Discovery. Waters Application Note. 720006517.