How to Maximize Bioanalytical Performance of Fc-Fusion Proteins: Practical Sample Preparation and LC-MS/MS Workflows for Dulaglutide Quantification from Plasma

Význam tématu

Dulaglutide představuje fúzní protein skládající se z analogu GLP-1 a lidské IgG4 Fc domény, jehož farmakokinetické vlastnosti jsou vylepšeny díky delší cirkulaci a nižší exkreci. Vysoce citlivá a specifická kvantifikace takových bioterapeutik je nezbytná pro preklinické farmakokinetické studie a vývoj nových léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout univerzální, rychlý a reprodukovatelný workflow pro přípravu vzorků a LC-MS/MS kvantifikaci Fc-fúzních proteinů na modelu dulaglutidu. Klíčové kroky zahrnují selektivní imunopurifikaci, optimalizovanou tryptickou digestu, SPE očistu a citlivou chromatografii s triple-quad hmotnostním detektorem.

Použitá metodika a instrumentace

• Imunopurifikace:Fúzní proteiny a interní standard (SILu MAb K4) byly zachyceny na streptavidinových magnetických kuličkách konjugovaných biotinylovanou anti-human Fc protilátkou. Blokace povrchu a přidání BSA minimalizovaly nespecifické vazby.
• Digesce:ProteinWorks Auto-eXpress Low Digest Kit ve třech krocích (denaturace RapiGestem, tryptická digesce při 45 °C, ukončení reakcí kyselinou) umožnil úplnou digesci za 2 hodiny bez redukce a alkylace.
• SPE:Oasis PRiME MCX µElution desorpční desky, mytí 2 % kyselinou mravenčí a 40 % acetonitrilem, eluace 1 % NH₄OH v 40 % acetonitrilu pro odstranění matrice a koncentrované obnovy peptidů.
• Chromatografie:ACQUITY UPLC I-Class PLUS s kolonkou Peptide BEH C18, 1.7 µm, 300 Å (2.1 × 100 mm), 80 °C, gradient 15–25 % B, tok 0.2 mL/min pro minimalizaci carry-over a optimální rozlišení.
• Detekce:Xevo TQ-XS Triple Quadrupole Mass Spectrometer s ESI+, analyza přechodů MRM peptidů HGEGTFTSDVSSYLEEQAAK a GLPSSIEK. Metoda sumuje dva nejcitlivější přechody pro každý peptid.

Použitá instrumentace

• Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS System
• ACQUITY UPLC Peptide BEH C18, 300 Å kolona
• Waters Xevo TQ-XS Triple Quadrupole Mass Spectrometer
• ProteinWorks Auto-eXpress Low Digest Kit
• Oasis PRiME MCX µElution SPE deska
• MassLynx 4.2 a TargetLynx XS software

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow dosáhl nižší meze kvantifikace 1 ng/mL (LLOQ) při použití 50 µL plasmy s lineárním rozsahem 1–10 000 ng/mL (r2 > 0.99). Intra- i interdenní přesnost byla v rozmezí ±15 %, preciznost <11 % CV. Optimalizace eliminačních kroků (zkrácená digesce, odstranění redukce/alkylace, silnější organické promytí SPE) vedla ke zvýšení obnovy a snížení pozadí matrice.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé nasazení nových kvantitativních metod pro Fc-fúzní proteiny
• Vysoká citlivost umožňující studium nízkých koncentrací v krevních vzorcích
• Modularita workflow pro různé proteiny a matice
• Snížení variability díky selektivnímu zachycení a standardizované digesci

Budoucí trendy a možnosti využití

Přechod na vysoce paralelní přípravu vzorků, automatizované platformy pro imunopurifikaci a digesci, a využití vysoce výkonných Q-TOF či HR-MS technologií pro multiplexní analýzy a rozšíření počtu analyzovaných proteinů v jediném běhu.

Závěr

Popsaný workflow představuje komplexní řešení pro vysoce citlivou a specifickou kvantifikaci Fc-fúzních proteinů, s důrazem na rychlost, reprodukovatelnost a minimalizaci matrice. LLOQ 1 ng/mL a robustní výkon potvrzují vhodnost metody pro preklinické PK studie.

Reference

• Glaesner W. et al. Diabetes Metab Rev. 2010;26(4):287–296.
• Kang L. et al. Anal. Chem. 2017;89(11):6065–6075.
• DrugBank DB09045 (sekvence dulaglutidu).
• Skyline software, MacCoss Labs, University of Washington.