LipidQuan: HILIC-Based LC-MS/MS High-Throughput Targeted Ceramide and Hexosylceramide Screen

Význam tématu

Plazmaticke a serove sfingolipidy, zejmena ceramidy a hexosylceramidy, hraji klicovou roli v bunecnych membranach a signalizaci, pritom jejich dysregulace souvisi s onemocnenimi jako Parkinsonova choroba ci rakovina. Presne stanovení techto lipidů muze prispet k lepsimu pochopeni biologickych procesu a vyuziti v klinicke diagnostice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, vysoke propustnou a cenove efektivní LC-MS/MS metodu zalozenou na HILIC chromatografii pro cilene stanovení 24 ceramidu, 23 hexosylceramidu a sfingosinu v malém objemu plasmy a sera. Metoda ma zajistit robustní kvantifikaci s minimalizovanou potrebou stabilne izotopove oznacenych standardu a snadnou implementaci v laboratornich prostredich.

Použitá metodika

Vzorky byly pripravovany srazkou proteinu predchladeny isopropanolem v pomeru 1:5, po odstredivce byly supernatanty prevedeny do vial pro chromatografii. Separace probiha na BEH Amide kolone pri toku 0,6 mL/min a gradiencni mobile phase v osmiminutovem behu. Hmotnostni spektrometr pracuje v pozitivnim ESI rezimu v MRM modu s charakteristickym produktovým iontem m/z 264 pro dlouhy retezec baze.

Použitá instrumentace

Ultravykonný chromatograf ACQUITY UPLC I-Class
BEH Amide kolona 2.1×100 mm, 1.7 µm
Hmotnostni spektrometry Xevo TQ-S micro a Xevo TQ-XS
Software TargetLynx, Quanpedia a Skyline

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila trideni lipidovych trid do casovych oken 0.4 az 1.1 minuty, cime se snizuje riziko isomerních a isobarních interferenci. Kalibracni krivky pro deuterovane ceramidy pokryly ctyri logaritmicke rozsahy s koeficientem determinace R2 nad 0.95 a akceptovatelnymi CV pod 30 procent pri hranicich kvantifikace. Analýza 50 µL plazmy vykazala dobrou citlivost pro endogenni koncentrace.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoka propustnost s celkovou dobou analyzy osmi minut
• Snížení nakladu na standardy diky tridnimu separacnimu pristupu
• Snadna nasaditelnost v ruznych laboratoriich a minimalizace rizika chybných nastaveni

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozsireni metodiky na dalsi kategorie lipidových analyz
• Integrace do klinickych lipidomickych studii a vyvoje biomarkeru
• Automatizace pripravy vzorku a pokrocile datove analyzy lipidomickych profilu

Závěr

Vyvinuta metoda poskytuje rychly, robustni a cenove efektivni pristup pro cilene kvantifikace ceramidu, hexosylceramidu a sfingosinu v plazme a seru. HILIC separace podle trid lipidů usnadnuje identifikaci a zkracuje dobu analyzy, soucasne snizuje naklady na standartni materialy, coz podporuje rozsahle lipidomicke studie i klinicke aplikace.

Reference

1. Merrill AH Jr. Sphingolipid and Glycosphingolipid Metabolic Pathways in the Era of Sphingolipidomics. Chem Rev. 2011;111(10):6387-6422.
2. Bieberich E. Ceramide Signaling in Cancer and Stem Cells. Future Lipidol. 2008;3(3):273-300.
3. Kosinska MK et al. Sphingolipids in Human Synovial Fluid – A Lipidomic Study. PLoS ONE. 2014;9(3):e91769.
4. Ogretmen B. Sphingolipid Metabolism in Cancer Signalling and Therapy. Nat Rev Cancer. 2018;18:33-50.
5. Mielke MM et al. Plasma Ceramide and Glucosylceramide Metabolism Is Altered in Sporadic Parkinsons Disease and Associated with Cognitive Impairment: A Pilot Study. PLoS ONE. 2013;8(9):e73094.
6. Cifkova E et al. Nontargeted Quantitation of Lipid Classes Using Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography–Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 2012;84(22):10064-10070.
7. Pulfer M, Murphy RC. Electrospray Mass Spectrometry of Phospholipids. Mass Spectrom Rev. 2003;22(5):332-364.
8. Munjoma N, Isaac G, Gethings L, Plumb R. LipidQuan: HILIC-based LC-MS/MS High-Throughput Targeted Phospholipids Screen. Waters Application Note. 2019.