LipidQuan: HILIC-Based LC-MS/MS High-Throughput Targeted Phospholipids Screen (PC, LPC, SM)

Význam tématu

Cholinové fosfolipidy jako fosfatidylcholin (PC), lysofosfatidylcholin (LPC) a sfingomyelin (SM) jsou klíčovou složkou buněčných membrán a jejich nerovnováha je spojena s řadou onemocnění (např. roztroušená skleróza, Niemann-Pickova choroba). Spolehlivé, rychlé a kvantitativní metody pro analýzu těchto lipidů v biologických vzorcích jsou proto zásadní pro biomedicínský výzkum i klinickou praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout vysoce výkonnou metodiku založenou na HILIC-LC-MS/MS pro cílenou analýzu 61 PC, 21 LPC a 24 SM ve vzorcích lidské plazmy během 8 minut. Studie demonstruje robustnost, citlivost, lineární dynamický rozsah a snadné nasazení metody v rutinních laboratořích.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: 50 µL lidské plazmy doplněné o stabilně značené standardy (SPLASH LIPIDOMIX). Extrakce: precipitace proteinů IPA (1:5 plasma:IPA), centrifugace 10 300g při 4 °C, přenos supernatantu.

Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class s BEH Amide kolonou (2,1×100 mm, 1,7 µm), teplota 45 °C, průtok 0,6 mL/min, gradient 0,1–20 % fáze B za 2 min, dále na 80 % za 3 min, návrat a re-ekvilibrace 3 min.

MS/MS: Xevo TQ-XS, TQ-S, TQ-S micro, ionizace ESI (+/-), MRM, zdroj 120 °C, desolvatace 500 °C, průtoky plynů 150/1000 L/h, napětí 2,8 kV (+), 1,9 kV (-).

Informatika: TargetLynx a Skyline, metodický soubor Quanpedia v1.4 obsahující LC/MS parametrizaci a MRM přechody.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje separace lipidů podle tříd (<1,52 min PC; ~1,92 min SM; ~2,15 min LPC), čtyřřádový lineární rozsah (R²>0,95) a detekci v nanogramových hladinách. Použití charakteristického fragmentu m/z 184 pro cholinovou skupinu ve spojení s MRM přechody na mastné acylové řetězce zvyšuje specifičnost a eliminuje izobarické rušení.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý screening 106 PC, 24 SM a 21 LPC za 8 minut.
• Snížené náklady díky jednomu SIL standardu na každou lipidovou třídu.
• Snadná implementace a přenos metodiky mezi laboratořemi.
• Podpora vysokokapacitních studií a QA/QC procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na další lipidové třídy (např. fosfatidylethanolaminy, ceramidy).
• Integrace s pokročilou bioinformatikou a strojovým učením pro identifikaci nových biomarkerů.
• Standardizace mezicentrových studií pro farmakokinetiku a metabolomiku.
• Automatizace přípravy vzorků a datového zpracování v rámci robotických platforem.

Závěr

Vyvinutá HILIC-LC-MS/MS metoda LipidQuan představuje rychlý, citlivý a nákladově efektivní nástroj pro cílenou kvantifikaci choline-obsahujících fosfolipidů v plazmě. Díky třídní separaci, optimalizovaným MRM přechodům a podpoře softwaru je vhodná pro vysokoproduktivní lipidomické studie a klinické aplikace.

Reference

1. Van Meer G., Voelker D.R., Feigenson G.W. Membrane Lipids: Where They Are and How They Behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008;9(2):112–124.
2. Hendriksz C.J. et al. The Hidden Niemann-Pick Type C Patient: Clinical Niches for a Rare Inherited Metabolic Disease. Curr. Med. Res. Opin. 2017;33(5):877–890.
3. Lee C.Y., Lesimple A., Larsen Å., Mamer O., Genest J. ESI-MS Quantitation of Increased Sphingomyelin in Niemann-Pick Disease Type B HDL. J. Lipid Res. 2005;46(6):1213–1228.
4. Cifkova E. et al. Nontargeted Quantitation of Lipid Classes Using HILIC-ESI-MS with Single Internal Standard and Response Factor. Anal. Chem. 2012;84(22):10064–10070.