Site-Specific Characterization of the O-linked Glycans at the Furin Cleavage Site of the Sars-CoV-2 Spike Protein using Cyclic IMS

Význam tématu

Charakterizace O-vázaných glykanů v oblasti štěpného místa furinu na S-proteinu SARS-CoV-2 je klíčová pro pochopení mechanismu aktivace viru a jeho průniku do buněk. Detailní poznání struktury glykanů v této oblasti může odhalit vazebná rozhraní s receptory a pomoci při návrhu antivirotik a vakcín.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo site-specificky a strukturálně identifikovat a odlišit čtyři tryptické O-glykoprofily (označené A–D) okolí furinového štěpného místa (peptid T56) S-proteinu SARS-CoV-2. Autoři využili kombinaci kolizně indukované disociace (CID) a cyklické iontové mobility (IMS) pro rozlišení izomerů s rozdílnými sialylacími vazbami.

Použitá metodika a instrumentace

Preparativní postup:

• Redukce a alkylace S-proteinu pomocí DTT (5 mM) a iodoacetamidu (15 mM).
• Hydrolýza trypsinem a ošetření PNGase F pro odstranění N-glykanů.
• Chromatografické rozdělení pomocí Waters nanoEase HSS T3 (100 Å, 1,8 μm, 75×15 mm) a trap kolony nanoEase M/Z Symmetry C18 (100 Å, 5 μm).
• Gradient eluce 10–35 % acetonitrilu s 0,1 % kyselinou mravenčí během 60 minut.

Iontová analýza:

• Kvadrupólová izolace glykopeptidů před CID v trap regionu.
• Iontová mobilita v cyklické iontové mobilitní buňce (1 a 5 průchodů) optimalizovaná na trisacharidové fragmenty.

Hlavní výsledky a diskuse

MS/MS spektra glykopeptidů A a C odhalila charakteristické oxoniové ionty (m/z 528, 657, 819, 1022). Pomocí jednoho průchodu IMS byly detekovány dvě mobilitní populace fragmentu m/z 657. Při pěti průchodech se dříve kratší drift times rozdělily na izomery s vazbami NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc (ATD ~73,2 ms) a NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc (ATD ~73,8 ms). Nejdelší drift time (~80,2 ms) odpovídalo isomeru NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc, potvrzujícímu přítomnost druhého izomeru prodlouženého core 1.

Tabulka čtyř zkoumaných glykopeptidů ukázala konzistentní rozdělení základních (core 1), rozšířených (extended core 1) i core 2 struktur v blízkosti furinového štěpného místa.

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysokému rozlišení IMS lze:

• Rozlišit sialyl-linkage izomery v glykopeptidech.
• Provést site-specifickou identifikaci O-glykanů na virových proteinech.
• Podpořit vývoj cílených antivirotik a vakcín prostřednictvím detailních glykoprofilů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace cyklické IMS do rutinních glykoprofilingových protokolů pro vysokou propustnost a automatizaci. Metodu lze rozšířit na analýzu glykanů dalších virových i buněčných glykoproteinů a klinických vzorků, podporovat screening lékových kandidátů a personalizovanou medicínu.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace CID a cyklické IMS dokáže spolehlivě rozlišit isomery O-vázaných glykanů na furinovém štěpném místě S-proteinu SARS-CoV-2. Pět průchodů IMS umožnilo oddělit sialyl-linkage formy α2-3 a α2-6 a potvrdit různé core struktury. Toto přináší nové možnosti detailní glykoprofilace virových proteinů a má význam pro virologický výzkum i farmaceutický průmysl.

Reference

1 Hoffmann M, Kleine-Weber H, Pöhlmann S. A Multibasic Cleavage Site in the Spike Protein of SARS-CoV-2 Is Essential for Infection of Human Lung Cells. Mol Cell. 2020;78(4):779–784.
2 Guttman M, Lee KK. Site-Specific Mapping of Sialic Acid Linkage Isomers by Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2016;88(10):5212–5217.