CONFIDENT O-GLYCOSYLATION SITE IDENTIFICATION USING A CYCLIC ION MOBILITY– MASS SPECTROMETER EQUIPPED WITH ECD FUNCTIONALITY

Význam tématu

Analýza O glykosylace proteinů je klíčová pro charakterizaci bioterapeutik, protože glykosylace ovlivňuje stabilitu, biologickou aktivitu a imunogenicitu léčiv
Stanovení přesných míst O glykosylace přispívá k validaci kvality a konzistentnímu výrobnímu procesu proteinových terapeutik, jako je etanercept

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje využití cyklického iontového mobilního spektrometru vybaveného buňkou pro electron capture dissociation k jednoznačné lokalizaci O glykosylace v peptidových fragmentech etanerceptu (Enbrel)
Prozkoumána byla především schopnost IMSn slicing a multi-pass IMS před ECD fragmentací izolovat a rozlišit izobarické glykopeptidy

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: trypsinový digest etanerceptu, koncentrace 2 až 4 µM pro infusion a LC-MS
• Spektrometr: SELECT SERIES Cyclic IMS s post IMS ExD buňkou (eMSion)
• Separace iontovou mobilitou: multi-pass IMS a IMSn slicing k rozlišení a izolaci před fragmentací
• Fragmentace: electron capture dissociation zachovává glykosidické vazby a umožňuje lokalizaci zbytků
• Chromatografie: ACQUITY I Class UPLC se CSH C18 kolonkou, gradient 1–35 % B za 25 minut při 60 °C
• Zpracování dat: ExDViewer BETA pro semiautomatickou anotaci spekter

Hlavní výsledky a diskuse

• Multi-pass IMS před ECD fragmentací umožnilo oddělit více izobarických forem glykosylovaných peptidů
• IMSn slicing zvýšilo selektivitu izolace minoritních komponent a odhalilo vzácné glykoformy
• Identifikováno bylo 11 O glykosidačních míst v etanerceptu, včetně pozičních izomer
• LC HDMSE ECD spojilo chromatografickou separaci s iontovou mobilitou a ECD, což vedlo k jednoznačnému přiřazení glykanů k peptidovým zbytkům

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká důvěra v lokalizaci O glykosylace u komplexních bioterapeutik
• Schopnost rozlišit poziční izomery bez potřeby chemické derivatizace
• Podpora QA/QC procesů pro validaci konzistence výrobních šarží

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj pokročilé iontové mobility a ECD bude dále umožňovat analýzu dalších labile posttranslačních modifikací
Kombinace s vysokorozlišovacími hmotovými spektrometry a automatizovaným zpracováním dat otevře nové možnosti v glykoproteomice a vývoji biosimilars

Závěr

Implementace cyklické iontové mobility s electron capture dissociation významně rozšiřuje schopnosti detailní analýzy O glykosylace
Přesné lokalizace glykozylovaných zbytků zvyšují spolehlivost charakterizace bioterapeutik a přispívají k lepší kontrole kvality

Reference

1. S Ippoliti D Cooper Shepherd Q Yu J I Langridge Confident O glycosylation Site Identification for ENBREL etanercept Using the ECD Functionality of SELECT SERIES Cyclic IMS System Application Note 720007458EN