Confident O-glycosylation Site Identification for ENBREL (etanercept) Using the ECD Functionality of SELECT SERIES Cyclic IMS System

Význam tématu

Glykozylace bioterapeutik je klíčová pro jejich stabilitu, účinnost a imunogenicitu. O-glykozylace je nesystematická a může probíhat na libovolných expozovaných serinových či threoninových zbytcích, což komplikuje její charakterizaci. Tradiční CID fragmentace často vede ke ztrátě labilech glykanů. Použití ECD fragmentace na cyklickém IMS systému nabízí možnost udržet glykanová vazby a přesně určit místní obsazení glykozylace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit schopnost selektivního ECD (electron capture dissociation) na SELECT SERIES Cyclic IMS přístroji pro jednoznačné přiřazení 11 O-glykopeptidů u léčiva ENBREL (etanercept). ENBREL představuje dimerickou fúzní bílkovinu s přechodovou doménou bohatou na O-glykozylované pozice.

Použitá metodika

Vzorek etanerceptu byl redukován, alkylován a podroben tryptickému štěpení. Peptidový digest byl analyzován kombinací RPLC a HDMSE nebo HDMS(E):

• Chromatografie na C18 kolóně: ACQUITY Premier CSH C18, gradient 1–35 % akrylonitrilu ve 25 min.
• Ionizace ESI a rozdělení v iontovém mobilitním spektrometru v single pass režimu.
• Fragmentace: CID pro obecný screening; ECD pro zachování glykanů a generování c- a z-iontů.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class System
• SELECT SERIES Cyclic IMS se zabudovanou ECD cely (před nebo za IMS buňkou)
• ACQUITY Premier CSH C18 Column (130 Å, 1.7 μm, 2.1×100 mm)

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo detekováno 11 O-glykopeptidů s různými glykoformami. Klíčovým příkladem jsou izobarické dvojice T19 peptidu (SMAPGAVHLPQPVSTR) s dvojnásobnou Core 1 glykozylací. ECD fragmentace odhalila rozdílné lokalizace sialylovaných i nesialylovaných glykanů na Ser199 a Thr200. Podobným způsobem byly potvrzeny glykozylace na Thr8 peptidu T1 a na Thr245 v T22-23 peptidu. Data pro všechny varianty byla shrnuta v tabulce obsazení glykozylace.

Přínosy a praktické využití metody

ECD na cyklickém IMS systému umožňuje:

• Retenci labilech glykanů a detailní určení jejich lokalizace.
• Rozlišení poločních izomerů O-glykopeptidů bez nutnosti dodatečných referenčních standardů.
• Zvýšenou citlivost a rozlišení díky IMS separaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení ECD fragmentace pro komplexní charakterizaci post-translačních modifikací v bioterapeutikách, zejména u proteinů s vysokou heterogenitou glykosidických vzorů. Kombinace IMS separace a ECD fragmentace nabídne nové možnosti pro rychlé a jednoznačné mapování glykozylace na analytické úrovni.

Závěr

Studie prokázala, že SELECT SERIES Cyclic IMS s ECD funkcionalitou je silný nástroj pro přesné mapování O-glykozylace v bioterapeutikách, kde tradiční CID fragmentace selhává. Umožňuje jednoznačné přiřazení glykanů i v případech blízkých modifikačních míst.

Reference

1. Houel S. et al., Anal Chem. 2014, 86, 576–584.
2. Voinov V.G. et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008, 22, 3087–3088.
3. Bakhtiar R., Guan Z., Biochem Biophys Res Commun. 2005, 334(1), 1–8.
4. Mulagapati S. et al., Biochemistry. 2017, 56(9), 1218–1226.