AUTOMATED SAMPLE PREPARATION FOR HYBRID LC-MS/MS PROTEIN QUANTIFICATION

Význam tématu

Proteinová kvantifikace pomocí LC-MS/MS je klíčová pro vývoj a monitorování biologických léčiv, ale komplexní příprava vzorků (afinitní purifikace, enzymatická štěpení, SPE) je časově náročná a variabilní. Automatizace tohoto procesu může výrazně zvýšit produktivitu laboratoře, snížit chyby a zajistit konzistentní výsledky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyhodnotit plně automatizovaný workflow pro přípravu vzorků (afinitní purifikace, proteinová digesce, SPE) na platformě Hamilton MicroLab STAR ve spojení s kity Waters ProteinWorks a porovnat jeho výkon s manuální přípravou. Testovány byly terapeutické protilátky infliximab, cetuximab, etanercept a trastuzumab.

Použitá metodika a instrumentace

• Automatizace: Hamilton MicroLab STAR (STAR) pro afinitní purifikaci, digesci a µElution SPE
• Proteolytické štěpení: Waters ProteinWorks™ Auto-eXpress Low 5 Digest Kit
• SPE čistění: ProteinWorks µElution SPE Clean-up Kit
• Chromatografie: ACQUITY UPLC Peptide BEH C18, 300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 150 mm, 0,3 mL/min, lineární gradient 0,1 % kyseliny mravenčí v H2O/ACN
• Hmotnostní spektrometrie: Waters Xevo® TQ-XS, ESI+

Hlavní výsledky a diskuse

• Digestační výkon: Automatické i manuální štěpení prokázalo srovnatelnou účinnost a variabilitu (%RSD < 5–7 % při QC úrovních).
• Afinitní purifikace: Výkony na magnetických perlách ukázaly obdobnou míru zachycení a reprodukovatelnost pro infliximab, etanercept a trastuzumab (normalizované plochy a %RSD < 7 %).
• Lineární kvantifikace: Detekční rozsahy 100–250 000 ng/mL pro vybrané peptidy s koeficienty determinace r2 > 0,995.
• Senzitivita a reproducibilita: LLOQ 100 ng/mL s přesností a opakovatelností v povolených mezích < 15 %.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace se projevila v:

• Výrazném zkrácení doby přípravy vzorků
• Snížení operátorské variability a chybných pipetážních kroků
• Možnosti zpracování vysokého počtu vzorků v režimu dávky
• Optimalizaci využití odborného personálu pro náročnější úlohy

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow o další třídy biologických makromolekul
• Integrace s vysokokapacitními UPLC systémy a vysokorozlišovacími MS přístroji
• Real-time monitoring digesce a adaptivní řízení protokolů
• Využití pro experimenty s multiplexní kvantifikací v preklinickém i klinickém prostředí

Závěr

Plně automatizovaný proces přípravy vzorků na platformě Hamilton STAR s kity Waters ProteinWorks poskytuje výkon srovnatelný s manuálními protokoly, nabízí vysokou reprodukovatelnost a široký dynamický rozsah kvantifikace. Zavedení tohoto řešení zefektivňuje workflow a podporuje robustní analytickou praxi v oblasti kvantifikace terapeutických proteinů.