Automating Sample Preparation Workflows for Hybrid LC-MS/MS Bioanalysis of Protein Therapeutics: Quantification of Etanercept Using Affinity Purification and Digestion

Význam tématu

Automatizace přípravy vzorků pro hybridní LC-MS/MS analýzu proteinových terapeutik představuje klíčový krok k dosažení vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a zvýšení propustnosti laboratoře. Kvantifikace velkomolekulárních bioterapeutik, jako je etanercept, vyžaduje komplexní vícekrokové postupy zahrnující imunopurifikaci a enzymatickou digestici. Ruční provádění těchto postupů je časově náročné a náchylné k chybám, proto automatizace výrazně zefektivňuje bioanalytické workflow.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout, optimalizovat a validovat plně automatizovaný protokol pro afinitní purifikaci a následnou enzymatickou digestici etanerceptu z laboratorní plazmy, umožňující citlivou a přesnou LC-MS/MS kvantifikaci v rozsahu od 1 ng/mL do 10 000 ng/mL. Postup byl nejprve ověřen na modelové vazbě pomocí Protein A pro infliximab a následně rozšířen na specifickou vazbu pomocí biotinylované protilátky a streptavidinových magnetických kuliček.

Použitá metodika a instrumentace

Pro automatizaci byly využity:

• Liquid handler Hamilton STAR s 8kanálovou pipetou, magnetem Alpaqua Magnum EX, grippy CORE a vortexovacím modulem
• ProteinWorks Auto-eXpress Low 5 Digest Kit pro denaturaci, redukci, alkylaci, digestici a ukončení reakce
• UPLC systém Waters ACQUITY UPLC I-Class Plus se sloupcem Peptide BEH C18 (300 Å, 2,1×150 mm, 1,7 µm)
• Mass spektrometr Xevo TQ-XS v režimu MRM s ESI+

Klíčové kroky zahrnovaly afinitní vazbu, promývání, eluční a neutralizační fázi a následnou tryptickou digestici přímo na automatu.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný protokol vykázal srovnatelnou účinnost s manuální přípravou s odchylkami v rámci ±15 % plochy signálu a RSD ≤10 %. Kalibrační křivky pro vybrané surrogate peptidy dosáhly lineární regrese r2 > 0,99 a LLOQ 1 ng/mL. QC vzorky vykázaly přesnost 96–107 % a RSD ≤10 %. Výsledky prokazují stabilitu a opakovatelnost automatizovaného workflow.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace šetří až dva dny vědecké práce tím, že umožňuje walk-away přípravu vzorků, snižuje variabilitu vlivem obsluhy a zvyšuje kapacitu zpracovat více vzorků denně. Metoda nachází uplatnění v biofarmaceutickém výzkumu, vývoji, QA/QC i preklinické i klinické bioanalýze.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry jsou rozšíření metodiky na multiplexní kvantifikaci několika proteinových léků současně, integrace enzymatické deglykosylace, zpracování komplexních biologických matic a využití pokročilých scénářů strojového učení pro optimalizaci skriptů a workflow.

Závěr

Vyvinutá a validovaná plně automatizovaná imunopurifikačně-digestní metoda poskytuje rychlou, citlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci etanerceptu z plazmy, splňující přísné bioanalytické požadavky. Implementace podobných přístupů výrazně zefektivní biofarmaceutické laboratoře a podpoří další rozvoj velkomolekulární analytiky.

Reference

• Delobel A., Quality Assurance, Advances in LC/MS methodologies for the characterization of complex glycoproteins – case study: etanercept, 2017.
• Grand View Research, Biologics market size worth $399.5 billion by 2025, 2017.
• Igea Hub Pharmaceutical Club, The complete list and analysis of the best selling drugs in 2017, 2018.
• MacCoss Labs, University of Washington, Skyline: targeted mass spec environment, 2017.
• Promega, Schematic of Antibody Purification using Magne Protein A Beads, prod. no. G8782.
• Promega, High Capacity Magne Streptavidin Beads and Goat Anti-Human Biotinylated IgG, prod. no. V7820.