Waters Application Notes - ProteinWorks

Význam tématu

V posledních letech roste význam LC-MS metod pro kvantifikaci protilátek a konjugátů protilátek (ADC) díky jejich vysoké specifičnosti, širokému dynamickému rozsahu a možnosti multiplexního stanovení. Standardní imunologické metody často trpí nedostatečnou reprodukovatelností reagens, omezenou lineární oblastí a dlouhým vývojem metod. Univerzální, kity založené přístupy usnadňují rychlou implementaci a přenos metod mezi laboratořemi a zároveň zajišťují vysokou citlivost a přesnost analýz.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo ověřit a demonstrovat lineární, rychlé a reprodukovatelné postupy pro kvantifikaci různých monoklonálních protilátek (infliximab, bevacizumab, adalimumab, trastuzumab), jejich ADC konjugátů (např. trastuzumab-emtansine), a to jak v přímé digesti plazmy, tak po afinitní purifikaci či precipitaci proteinů. Součástí bylo také porovnání kvantitativních parametrů pro různé objemy vzorku, test reproducibility mezi kity a validace generického vnitřního standardu (intaktní murinní protilátka).

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků se využívaly ProteinWorks eXpress Direct Digest Kits a ProteinWorks µElution SPE Clean-up Kits s předem odměřenými, zaregistrovanými reagens. Digesty plazmy (15–70 µL) procházely reduct-alkylací, tryptickou digestí, následným SPE clean-upem bez nutnosti odpařování. Chromatografie: ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 kolona (300 Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm). Detekce: Waters Xevo TQ-S s ESI+ režimem a MassLynx v4.1 pro datové zpracování.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kvantifikační limity (LLOQ): infliximab 10 ng/mL, bevacizumab 100 ng/mL, ostatní mAb 0,25–2,5 µg/mL.
• Lineární oblast standardních křivek: 3,5–4 dekády s koeficientem r2 ≥ 0,99 a průměrnou přesností 95–105 %.
• Přesnost a preciznost QC: CV QC bodů často < 5 % (intra- i inter-kit CV < 10 %).
• Pellet digest s precipitací isopropanolem + TFA významně snížil hladiny albuminu a 2–8× zvýšil signál protilátkových peptidů (trastuzumab).
• Zjištěny miscleavage peptidy ADC (FTISADTSKNTAYLQMNSLR, GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK), eluce diastereomerních párů a diagnostický fragment 547 m/z.
• Optimalizovaný µElution SPE protokol s Oasis MCX 96-well deskou poskytl průměrnou recov. 84–104 % pro sledované peptidy.
• Murinní intaktní protilátka slouží jako generický IS a kontrolní standard pracovního postupu.

Přínosy a praktické využití metody

Kit-based workflow zásadně redukuje čas vývoje metod (do 4–6 h) a minimalizuje riziko chyb v komplexních krocích (afilace, digest, SPE). Výsledný protokol je vhodný pro méně zkušené analytiky, umožňuje snadný přenos mezi laboratořemi a podporuje vysokou kvalitu dat při preklinických i raných klinických studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací na nové ADC a biosimilars v prostředí mikro-sampování (objemy vzorků < 15 µL).
• Automatizace preparativních kroků a integrace online SPE pro další zvýšení throughputu.
• Vývoj nových sorbentů a multimodálních separačních technik pro selektivnější clean-up.
• Multiplexní kvantifikace endogenních biomarkerů souběžně s terapeutickými protilátkami.

Závěr

Kity ProteinWorks eXpress Digest a µElution SPE představují univerzální a vysoce reprodukovatelný systém pro LC-MS/MS kvantifikaci protilátek a ADC. Metoda splňuje požadavky na citlivost, linearitu i preciznost, usnadňuje implementaci a zkracuje čas potřebný k získání spolehlivých výsledků v bioanalytických studiích.

Reference

1. FDA Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, CDER.
2. McKinsey and Company; Evaluate Pharma US Patent Expiration Dates.
3. Dalzell, Managed Care, October 2013.
4. Medicines in Development: Biologics, PhRMA report 2013.
5. Peddi PF, Hurvitz SA. Future Oncology, 2013;9(S1):36–42.
6. Barok M, Joensuu H, Isola J. Breast Cancer Research, 2014;16(2):209.