Automated, Kit-Based Sample Preparation Strategy for LC-MS Quantification of Cetuximab in Rat Plasma
Aplikace | 2018 | WatersInstrumentace
Monoklonální protilátky (mAbs) představují klíčovou třídu biologických léčiv s vysokou účinností a specifitou. Jejich kvantifikace v biologických matricích je nezbytná v preklinickém a klinickém výzkumu pro určení farmakokinetiky, bezpečnosti a účinnosti. Tradiční ligandově vázané testy (LBA) trpí omezenou dynamikou a opakovatelností, což vede k širší adopci LC-MS/MS přístupu kombinu jícímu citlivost, specifičnost a širší kvantifikační rozsah.
Studie se zabývá vyvinutím plně automatizované, sady reagencií řízené přípravy vzorků pro kvantifikaci monoklonální protilátky cetuximab v séru potkana. Klíčovým cílem bylo dosáhnout nízkého dolního limitu kvantifikace (LLOQ) 100 ng/mL při vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti, přičemž všechny kroky budou prováděny na platformě Hamilton Microlab STAR.
Vzorky potkaní plazmy (40 µL) byly obohaceny o cetuximab (0,1–250 µg/mL) a stabilně izotopově značený SILuMAB (IS). Následovala redukce, alkylace, tryptická digesce a SPE čistění:
Automatizovaný protokol zkrátil dobu přípravy vzorku na 6 hodin a dosáhl LLOQ 0,1 µg/mL pro vybrané signature peptidy cetuximabu. Kalibrační křivky byly lineární v rozsahu 0,1–250 µg/mL (r²>0,99), průměrné odchylky přesnosti kolem 99–101 % a mezi-běhové CV ≤15 %. Ukázkové chromatogramy pro DILLTQSPVILSVSPGER a další signální peptidy prokázaly robustní separaci a nízký šum v matrix.
Očekává se rozšíření automatizovaných workflow pro multiplexní kvantifikaci více protilátek současně, využití imunoafinity pro cílené obohacení nízkoabundantních analytů a integrace pokročilých datových řešení pro rychlou validaci a reporting. Miniaturizace a plná robotizace laboratoří umožní další zvýšení kapacity a efektivity.
Implementace ProteinWorks Auto-eXpress Digest a µElution SPE Clean-up Kits na Hamilton STAR přináší reprodukovatelné, vysoce citlivé a široce aplikovatelné řešení pro kvantifikaci cetuximabu v potkaní plazmě. Workflow dosahuje LLOQ 100 ng/mL, lineárního rozsahu přes 3 řády a splňuje požadavky regulačních norem.
1. Grand View Research: Biologics market size worth $399.5 billion by 2025 (2017).
2. Grand View Research: Monoclonal antibodies market size worth $138.6 billion by 2024 (2016).
3. Marnett Research Laboratory, Department of Biochemistry: Cetuximab overview (2017).
4. FDA Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, CDER.
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
ZaměřeníKlinická analýza
VýrobceWaters
Souhrn
Význam tématu
Monoklonální protilátky (mAbs) představují klíčovou třídu biologických léčiv s vysokou účinností a specifitou. Jejich kvantifikace v biologických matricích je nezbytná v preklinickém a klinickém výzkumu pro určení farmakokinetiky, bezpečnosti a účinnosti. Tradiční ligandově vázané testy (LBA) trpí omezenou dynamikou a opakovatelností, což vede k širší adopci LC-MS/MS přístupu kombinu jícímu citlivost, specifičnost a širší kvantifikační rozsah.
Cíle a přehled studie / článku
Studie se zabývá vyvinutím plně automatizované, sady reagencií řízené přípravy vzorků pro kvantifikaci monoklonální protilátky cetuximab v séru potkana. Klíčovým cílem bylo dosáhnout nízkého dolního limitu kvantifikace (LLOQ) 100 ng/mL při vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti, přičemž všechny kroky budou prováděny na platformě Hamilton Microlab STAR.
Použitá metodika a instrumentace
Vzorky potkaní plazmy (40 µL) byly obohaceny o cetuximab (0,1–250 µg/mL) a stabilně izotopově značený SILuMAB (IS). Následovala redukce, alkylace, tryptická digesce a SPE čistění:
- Digestní sada: ProteinWorks Auto-eXpress High 5 Digest Kit
- SPE čistění: ProteinWorks µElution SPE Clean-up Kit na Oasis MCX platni
- Automatizace: Hamilton Microlab STAR s dvěma heater shakers, vakuovým manifoldem a sealerem
- Chromatografie: ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 (2,1×150 mm, 1,7 µm, 300 Å)
- Detekce: Xevo TQ-S Mass Spectrometer (ESI+, MassLynx v4.1, TargetLynx)
Hlavní výsledky a diskuse
Automatizovaný protokol zkrátil dobu přípravy vzorku na 6 hodin a dosáhl LLOQ 0,1 µg/mL pro vybrané signature peptidy cetuximabu. Kalibrační křivky byly lineární v rozsahu 0,1–250 µg/mL (r²>0,99), průměrné odchylky přesnosti kolem 99–101 % a mezi-běhové CV ≤15 %. Ukázkové chromatogramy pro DILLTQSPVILSVSPGER a další signální peptidy prokázaly robustní separaci a nízký šum v matrix.
Přínosy a praktické využití metody
- Vyšší průtok a konzistence oproti manuálním postupům
- Minimalizace lidské chyby a variability mezi běhy
- Možnost aplikace v preklinických studiích PK/PD, bioekvivalenčních testech a toxikologii
- Rychlá adaptace na jiné monoklonální protilátky díky modulární struktuře sad
Budoucí trendy a možnosti využití
Očekává se rozšíření automatizovaných workflow pro multiplexní kvantifikaci více protilátek současně, využití imunoafinity pro cílené obohacení nízkoabundantních analytů a integrace pokročilých datových řešení pro rychlou validaci a reporting. Miniaturizace a plná robotizace laboratoří umožní další zvýšení kapacity a efektivity.
Závěr
Implementace ProteinWorks Auto-eXpress Digest a µElution SPE Clean-up Kits na Hamilton STAR přináší reprodukovatelné, vysoce citlivé a široce aplikovatelné řešení pro kvantifikaci cetuximabu v potkaní plazmě. Workflow dosahuje LLOQ 100 ng/mL, lineárního rozsahu přes 3 řády a splňuje požadavky regulačních norem.
Reference
1. Grand View Research: Biologics market size worth $399.5 billion by 2025 (2017).
2. Grand View Research: Monoclonal antibodies market size worth $138.6 billion by 2024 (2016).
3. Marnett Research Laboratory, Department of Biochemistry: Cetuximab overview (2017).
4. FDA Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, CDER.
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
Quantification of Rituximab in Plasma Using an Automated and Standardized Kit-Based Approach
2018|Waters|Aplikace
[ APPLICATION NOTE ] Quantification of Rituximab in Plasma Using an Automated and Standardized Kit-Based Approach Mary Lame, Paula Orens, and Steven Calciano Waters Corporation, Milford, MA, USA APPLICATION BENEFITS INTRODUCTION Automated and standardized approach In the past decade, monoclonal…
Klíčová slova
proteinworks, proteinworksrituximab, rituximabstandardized, standardizedglewigaiypgngdtsynqk, glewigaiypgngdtsynqkexpress, expressvdnalqsgnsqesvteqdsk, vdnalqsgnsqesvteqdskstar, starhamilton, hamiltonmicrolab, microlabdigest, digestkit, kitquantification, quantificationplasma, plasmaautomated, automatedµelution
Accurate and Sensitive LC-MS/MS Quantification of Adalimumab in Serum/Plasma: Impact of Sample Preparation on Method Performance
2018|Waters|Aplikace
[ APPLICATION NOTE ] Accurate and Sensitive LC-MS/MS Quantification of Adalimumab in Serum/Plasma: Impact of Sample Preparation on Method Performance Caitlin Dunning, Mary Lame, Steven Calciano, and Kelly Doering Waters Corporation, Milford, MA, USA APPLICATION BENEFITS ■■ ■■ Speed and…
Klíčová slova
adalimumab, adalimumabserum, serumglewvsaitwnsghidyadsvegr, glewvsaitwnsghidyadsvegrquantification, quantificationnylawyqqkpgk, nylawyqqkpgkapytfgqgtk, apytfgqgtkproteinworks, proteinworksplasma, plasmaspe, speprotein, proteinpeptide, peptideaccurate, accuratedigestion, digestiondigest, digestsensitive
AUTOMATED SAMPLE PREPARATION FOR HYBRID LC-MS/MS PROTEIN QUANTIFICATION
2020|Waters|Postery
AUTOMATED SAMPLE PREPARATION FOR HYBRID LC-MS/MS PROTEIN QUANTIFICATION Paula Orens and Mary Lame Waters Corporation, 34 Maple St Milford, MA 01757 INTRODUCTION METHODS Sample Preparation Whole Plasma Samples Using the Waters ProteinWorks™ (ProteinWorks) Auto-eXpress Direct Digest and µElution SPE CleanUp…
Klíčová slova
automated, automatedpeptide, peptidedigestion, digestionetanercept, etanerceptdilltqspvilsvspger, dilltqspvilsvspgerproteinworks, proteinworksquantification, quantificationarea, areaprotein, proteinyase, yaseyasesisgipsr, yasesisgipsrlinear, linearnormalized, normalizeddill, dillsqvffk
Automated and Standardized, Kit-Based Workflow for Protein Quantification
2018|Waters|Aplikace
[ TECHNOLOGY BRIEF ] Automated and Standardized, Kit-Based Workflow for Protein Quantification Mary Lame, Paula Orens, and Steven Calciano Waters Corporation, Milford, MA, USA Bottom-up, protein quantification workflows are time consuming and complex. A need exists for simpler and standardized…
Klíčová slova
proteinworks, proteinworkscrp, crpexpress, expressdigest, digestinfliximab, infliximabkits, kitsasqf, asqfafv, afvauto, autosins, sinsdill, dilllees, leesesd, esdautomated, automatedtryptic
