Direct Analysis of In-Process Oligonucleotides Without Manual Purification

Význam tématu

Oligonukleotidy jsou nezbytné v molekulární biologii, diagnostice i vývoji terapeutik. Po anion-exchange purifikaci obsahují vysokou koncentraci solí, které narušují analýzu ion-pair reverzní fází (IP-RPLC). Tradiční manuální desalting je časově náročný a náchylný k chybám. Online 2D-LC s automatickým odváděním solí v první dimenzi a IP-RPLC v druhé dimenzi nabízí zrychlení, vyšší reprodukovatelnost a eliminaci manuálních kroků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat přímou analýzu in-process oligonukleotidů bez manuální desaltingové přípravy. Autoři stanovili workflow 2D-LC, kde první dimenze provádí online odstranění solí a druhá dimenze zajišťuje IP-RPLC separaci. Porovnali tento přístup s klasickou jednorozměrnou IP-RPLC analýzou vyžadující manuální centrifugační filtry.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow bylo realizováno na Agilent 1290 Infinity II 2D-LC:

• Dva vysokotlaké pumpy
• Multisampler s chlazením
• Dva multikolónové termostaty
• Dva detektory DAD s 10 mm kyvetou
• 2D-LC rozvaděče a aktivní modulace
• Ventily pro heart-cutting se smyčkami 40 µL

Kolóny:

• 1D: PLRP-S, 2.1 × 50 mm, 3 µm, 50 mM ammonium acetát pH 7 / methanol
• 2D: AdvanceBio Oligonucleotide, 2.1 × 50 mm, 2.7 µm, 400 mM HFIP + 15 mM TEA / HFIP:metanol (50:50)

1D provádí tříbodové skokové gradienty a vygazuje sůl do odpadu, poté vybraný frakční „heart-cut“ putuje do 2D pro IP-RPLC separaci.

Hlavní výsledky a diskuse

1D IP-RPLC analýza standardního oligonukleotidu v 1 M NaCl vykázala výrazné štěpení a průlomy špiček. Manuální desalting trval ~75 min a odstranil tyto artefakty. 2D-LC s online desaltingem dosáhla srovnatelné kvality separace, ale kompletní cyklus analýzy zkrátila z 96 min na 26 min. Retenční doby i oblasti píků měly RSD pod 1 % v obou dimenzích. Čistota hlavní špičky byla ~96 %, shodná s manuálně desaltovanou vzorkou.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace manuálního desaltingu snižuje pracovní náročnost a riziko ztráty vzorku.
• Více než třikrát vyšší propustnost vzorků zlepšuje výkonnost QA/QC laboratoří.
• Metoda je vhodná pro in-process kontrolu syntézy oligonukleotidů a dalších biologik s vysokou solností.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na analýzu dalších biomolekul s vysokým obsahem solí.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturální charakterizaci.
• Využití plně automatizovaných 2D-LC systémů v klinických a výrobních provozech.

Závěr

Heart-cutting 2D-LC s online desaltingem na Agilent 1290 Infinity II nabízí rychlou, reprodukovatelnou analýzu in-process oligonukleotidů bez manuální přípravy. Workflow zkracuje čas analýzy o více než 70 %, zachovává vysokou čistotu a přesnost měření.

Reference

1. Mangano P. et al. Composition dependent separation of oligonucleotides by capillary electrophoresis in acidic buffers. J Chromatogr A. 1999;848:435–442.
2. Zimmermann M. et al. Synthetic oligonucleotide separations by mixed-mode reversed-phase/weak anion-exchange liquid chromatography. J Chromatogr A. 2014;1354:43–55.
3. Mustonen P. et al. Oligonucleotide-based pharmaceuticals: Non-clinical and clinical safety signals and non-clinical testing strategies. Regul Toxicol Pharmacol. 2017;90:328–341.
4. Shanagar A. Purification of a synthetic oligonucleotide by anion exchange chromatography: Method optimization and scale-up. J Biochem Biophys Methods. 2005;64:216–225.
5. Cramer F., Herzberg O. Purity analysis and impurities determination by reversed-phase high-performance liquid chromatography. In: Bonilla A., Srivatsa S., eds. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. CRC Press; 2011:28–34.