Optimizing Separation of Oligonucleotides with Anion‑Exchange Chromatography

Význam tématu

Regulace genové exprese pomocí syntetických oligonukleotidů představuje rostoucí oblast v biotechnologii a farmacii. Čistota a homogenní složení oligonukleotidů jsou klíčové pro jejich účinnost a bezpečnost, přičemž běžné nečistoty zahrnují zkrácené řetězce, depurinace a další modifikace vznikající při syntéze. Efektivní separace a purifikace jsou proto nepostradatelné pro vývoj nových terapeutik a garantování reprodukovatelných výsledků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat separaci oligonukleotidů délky 25–100 bazí pomocí silné aniontové výměnné chromatografie (SAX). Zkoumány byly hlavní faktory ovlivňující rozlišení a účinnost separace, zejména složení mobilní fáze (NaCl, pH, organické modifikátory) a teplota kolony. Součástí bylo také ověření workflow SAX frakcionace následované analýzou čistoty pomocí reverzní iontové párové RP-LC/UV a LC/MS.

Použitá metodika

Pro chromatografii SAX byla použita kolona PL-SAX 2,1 × 50 mm, 5 μm, mobilní fáze A tvořila 10 mM Tris pH 8, případně 10 mM NaOH pH 12, mobilní fáze B obsahovala 2 M NaCl s volitelným 10 % acetonitrilem. Lineární gradienty 10–30, 20–40 a 25–45 % B během 10 minut byly nastaveny při teplotách 30, 60 a 80 °C. Frakcionace vzorku 100 mer při pH 12 umožnila izolovat plnohodnotný produkt. Získané frakce byly vysušeny, rekonstituovány a podrobeny RP-LC/UV a LC/MS analýze pro identifikaci nečistot.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC systém s bio-inertními komponentami
• Diode Array Detector (DAD) pro UV detekci
• Vysokorychlostní pumpa a multicolumn termostat
• Agilent 6530 Q-TOF LC/MS se zdrojem Jet Stream ESI
• Software Agilent MassHunter pro akvizici i zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Zařazení 10 % acetonitrilu do 10 mM Tris pH 8 vedlo k výraznému zlepšení účinnosti separace a ostřejší špičce oproti čisté Tris metodě. Mobilní fáze pH 12 poskytla ještě větší rozlišení, ale vedla také k časnému vylučování truncovaných a depurínovaných oligonukleotidů. Zvýšení teploty kolony na 80 °C s 10 % acetonitrilem významně potlačilo sekundární struktury u sgRNA, čímž se dosáhlo nejlepších chromatografických výsledků. SAX frakcionace potvrdila frakci č. 4 jako nejčistší produkt, což LC/MS ověřila detekcí plné délky oligonukleotidu a charakterizací aduktů sodíku a zbytkových modifikací v ostatních frakcích.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované SAX protokoly nabízejí alternativu k ion-pair RP-LC s využitím bezvolatilních pufrů, snadnou škálovatelnost a lepší kompatibilitu s MS. Metoda umožňuje účinnou purifikaci terapeutických a výzkumných oligonukleotidů, zlepšuje kvalitu finálního produktu a zrychluje vývojové cykly.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je automatizace preparativní SAX purifikace a integrace s on-line MS detekcí pro detailní profilaci nečistot. Rozšíření metodiky na modifikované oligonukleotidy (LNA, 2′-OMe) a validace pro velkosériovou výrobu otevře nové možnosti v RNA-terapii.

Závěr

Studie demonstrovala, že pečlivá volba pH, organického modifikátoru a teploty kolony výrazně ovlivňuje kvalitu separace oligonukleotidů na SAX. Navržený postup kombinující SAX frakcionaci s RP-LC/UV a LC/MS analýzou poskytuje robustní platformu pro purifikaci a charakterizaci oligonukleotidů.

Reference

1. Roberts, T. C.; Langer, R.; Wood, M. J. A. Advances in Oligonucleotide Drug Delivery. Nature Reviews Drug Discovery 2020, 19, 673–694.
2. Bajan, S.; Hutvagner, G. RNA-Based Therapeutics: From Antisense Oligonucleotides to miRNAs. Cells 2020, 9(1), 137.
3. Kanavarioti, K. HPLC Methods for Purity Evaluation of Man-Made Single-Stranded RNAs. Scientific Reports 2019, 9(1), 1019.