Agilent 1260 Infinity II Flexible Pump with Blend Assist

Význam tématu

Rychlá a přesná změna koncentrace pufrů nebo modifikátorů v kapalinové chromatografii umožňuje efektivní optimalizaci separace biologicky aktivních látek, peptidů či farmaceutických sloučenin. Automatizovaná funkce Blend Assist u Agilent 1260 Infinity II Flexible Pump odstraňuje ruční a časově náročné míchání mobilních fází a zvyšuje reprodukovatelnost a flexibilitu metod developementu.

Cíle a přehled studie / článku

Technické shrnutí představuje dva hlavní přístupy využití Blend Assist:

• Optimalizace separace 10-peptidového standardu změnou koncentrace trifluoroctové kyseliny (TFA).
• Multimethod analýza tří různých skupin sloučenin (sulfa léky, testosterony a peptidový standard) s on-line úpravou koncentrace amonium formiátu ve třech metodách v jedné sekvenci.

Použitá metodika a instrumentace

Pro obě studie byla použita sestava Agilent 1260 Infinity II:

• Flexible Pump G7104C s V380 Jet Weaver mixerem pro quaternární míchání a Blend Assist.
• Vialsampler G7129C s integrovaným chlazením vzorků.
• MCT G7116A pro konstantní teplotu kolony.
• Diode Array Detector G7117C pro detekci UV absorbance.
• Software Agilent OpenLAB CDS pro řízení systému.

Chemikálie a pufry:

• LC-grade voda a acetonitril.
• Trifluoroctová kyselina (TFA) pro optimalizaci separace peptidů.
• Amonný formiát v koncentracích 25–200 mM pro multimethod přístup.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace TFA pro 10-peptidový standard:

• Zvýšení koncentrace TFA z 0,05 na 0,3 % vedlo k postupnému zlepšení rozlišení, přičemž 0,2 % zajistila baseline separaci kritických párů Neurotensin–Angiotensin I a 0,3 % dále zvýšila rezoluci až na 2,25.
• Srovnání Blend Assist vs. manuální míchání 0,3 % TFA potvrdilo téměř identické chromatogramy, RT RSD < 0,15 % a podobné hodnoty rozlišení.

Multimethod analýza tří skupin sloučenin:

• Sulfa léky při 200 mM amonium formiátu – RT RSD pod 0,1 % pro všechny čtyři analyty.
• Testosterony při 50 mM amonium formiátu – výborné oddělení a RT RSD < 0,12 %.
• Peptidový standard při 25 mM amonium formiátu – RT RSD výrazně pod specifikací 0,15 %.

Přínosy a praktické využití metody

Blend Assist výrazně zrychluje vývoj metod a eliminuje potřebu ručního míchání mobilních fází. Metoda zvyšuje laboratorní efektivitu, šetří spotřebu pufrů a redukuje chybovost při přípravě fází. Kombinace precizního quaternárního míchání a softwarové kontroly zaručuje vysokou reprodukovatelnost chromatografických běhů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření on-line optimalizace gradientů i pro komplexní biologické matrixy, adaptivní metodiky, ve kterých se koncentrace modifikátorů nastavuje v reálném čase podle signálu detektoru, a integrace s hmotnostní spektrometrií. Dále je možné aplikovat Blend Assist pro rychlý screening pufrovacích podmínek v biofarmaceutickém vývoji.

Závěr

Agilent 1260 Infinity II Flexible Pump s funkcí Blend Assist prokázala vysokou spolehlivost a přesnost při on-line změnách koncentrace modifikátorů. Funkce umožňuje snadné optimalizace chromatografických podmínek i multimethod provoz v jedné sekvenci, přičemž zachovává výbornou retenci, opakovatelnost a rozlišení.

Reference

1. Huesgen A.G. Fast and Flexible Optimization of Modifier Concentrations Using an Agilent 1290 Infinity LC System with Blend Assist. Agilent Technologies Technical Overview, 5991-2169EN, 2013.