Benefits of 2D-LC/MS/MS in Pharmaceutical Bioanalytics

Význam tématu

V bioanalytice farmaceutických látek představuje spolehlivá kvantifikace léčiv a jejich metabolitů v komplexních biologických matricích zásadní krok pro stanovení farmakokinetických parametrů a bezpečnosti nových sloučenin. Jednorozměrná chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií často čelí potížím s potlačením signálu, křížovou interferencí či neadekvátními podmínkami ionizace.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo ukázat možnosti použití 2D-LC/MS/MS v prostředí farmaceutického výzkumu pro eliminaci koeluce, redukci potlačení signálu a křížové interferencí a zároveň zvýšení citlivosti detekce prostřednictvím optimalizace eluční fáze před vstupem do MS zdroje.

Použitá metodika a instrumentace

Pro obě studie byl použit systém Agilent InfinityLab 2D-LC spojený s hmotnostním spektrometrem Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS. První dimenze využívala C18 kolonku s kyselinou mravenčí ve vodě a organickém modifieru, druhá dimenze pracovala se sub-2 µm kolonami (např. PFP nebo neendcapped silica C18) a různými eluenty (methanol s kyselinou mravenčí či roztokem amonných solí). Přenos selektovaných frakcí byl realizován srdcovým střiháním (heart-cutting), kolony byly temperovány na 40 °C a přívod do ESI zdroje zajišťoval Agilent Jet Stream.

Hlavní výsledky a diskuse

V prvním modelu buněčné suspenze vedlo aplikované 2D-LC k separaci metabolitu označeného M1 od vysoce koncentrovaných substrátů a inhibitorů, čímž se potlačení signálu prakticky eliminovalo. Ve srovnání s 1D metodou, kde M1 vykazovalo 506 717 counts, 2D separace zajistila čisté pásmo bez interferencí.
Ve druhé studii byla optimalizována citlivost MS detekce přepnutím eluční fáze ve druhé dimenzi na methanol s amonnými solemi. Po přenosu pěti vybraných sloučenin ze 1D do 2D byla zvýšena intenzita signálu metabolitu M1 z 61 533 na 191 646 counts, tedy o faktor patnáct, a současně se zkrátil čas analýzy ze 9,5 na 6,5 minuty.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace koeluce a potlačení signálu v složitých matricích
• Redukce počtu jednotlivých metod a časová úspora díky vícekomponentnímu přístupu
• Zvýšení citlivosti a rozšíření kvantifikačních limitů
• Možnost použití univerzálního interního standardu pro náročné vzorky

Budoucí trendy a možnosti využití

Při dalším rozvoji lze očekávat integraci automatizovaných 2D-LC systémů s digitálními nástroji pro návrh optimálních heart-cut schémat, využití dalších ortogonálních fází pro široké spektrum analytů a miniaturizaci druhé dimenze ke zvýšení throughputu.

Závěr

Popsaná 2D-LC/MS/MS strategie pro bioanalýzu léčivých látek překonává limity jednorozměrné metody tím, že zajišťuje čistou separaci od interferujících složek a výrazně zvyšuje citlivost hmotnostní spektrometrie. Tím se otevírají nové možnosti pro přesné a spolehlivé kvantitativní stanovení v preklinických i klinických studiích.

Reference

• Vanhoenacker G et al Two-Dimensional LC/MS/MS to Reduce Ion Suppression in the Determination of Cannabinoids in Blood Plasma Agilent Application Note 5991-7859EN 2017