Two-Dimensional LC/MS/MS to Reduce Ion Suppression in the Determination of Cannabinoids in Blood Plasma

Význam tématu

Detekce psychoaktivních látek a jejich metabolitů v krevní plasmě je klíčová zejména v soudní toxikologii, dopravní kontrole i v kontrolních programech zaměstnanců. Analýza kanabinoidů, zejména Δ-9-tetrahydrokanabinolu (THC) a jeho hlavních metabolitů (THC-COOH, THC-OH) v plazmě je však komplikována silným potlačením signálu (ion suppression) způsobeným matričními složkami jako proteiny a fosfolipidy. Potlačení signálu vede k nižší citlivosti i reprodukovatelnosti analýzy, a tím k riziku falešně negativních výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat, jak použitím dvoudimenzionální LC/MS/MS (Agilent 1290 Infinity II 2D-LC s vysokým rozlišením vzorkování a Agilent 6495 Triple Quadrupole) lze významně omezit ionizační potlačení při stanovení kanabinoidů v krevní plasmě po minimální přípravě vzorku. Studie demonstruje postupy jedno- a dvoudimenzionální chromatografie, optimalizaci lomových časů a výběr srdce eluce (heart-cut) pro jednotlivé analyty.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly připraveny jednoduchým přímým srážením proteinů acetonitrilem (1:1), odstředěním a přímou injekcí 40 µL do LC. V první dimenzi byla použita kolona C18 (2.1×50 mm) s gradientem amonného acetátu/methanolu, vybraný srdcový výřez eluce pro THC, THC-OH a THC-COOH byl převeden na druhou dimenzi. V druhé dimenzi se uplatnila kolona phenyl-hexyl (3.0×50 mm) s formiovou kyselinou/methanolem. V MS byly nastaveny optimalizované prekurzor-produkt přechody (MRM) pro pozitivní i negativní ionizaci.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II High Speed Pump (G7120A)
• Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)
• Agilent 1290 Infinity II Multicolumn Thermostat (G7116B)
• Agilent 1290 Infinity II Valve Drives (G1170A) s dua-ventily a heart-cut ventily
• Agilent low dispersion kit pro 1290 II LC (5067-5963)
• Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS s Jet Stream zdrojem (G6495A)
• Agilent OpenLab CDS ChemStation Edition C.01.07 a 2D-LC software A.01.02

Hlavní výsledky a diskuse

Jednodimenzionální analýza prokázala až 100% potlačení signálu THC a 58–74% potlačení THC-OH/THC-COOH. Prodloužení kolony z 50 na 100 mm mírně zlepšilo rozlišení, avšak signál THC zůstal příliš nízký pro kvantifikaci. Aplikací vysoce rozlišujících výřezů eluce (MHC) v 2D-LC bylo dosaženo:

• oddělení kanabinoidů od interferenčních matrikových složek,
• nárůstu signálu THC o řád,
• snížení potlačení pro THC-OH na 28 %,
• vynikající opakovatelnosti (RSD < 5 % pro 5 ng/mL u THC-COOH, < 8 % u THC-OH, < 10 % pro THC v 2D-LC).

Lineární oblast metody pokrývá 0,1–50 ng/mL se záchytnými limity < 0,1 ng/mL.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou přípravu vzorku bez složitých extrakčních kroků s vysokou citlivostí a přesností stanovení hlavních kanabinoidů v plazmě. Díky 2D-LC heart-cut přístupu lze simultánně kvantifikovat THC i jeho metabolity na jednom LC/MS/MS systému v forenzních a kontrolních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace může spočívat ve výběru alternativních druhově odlišných stacionárních fází či mobilních fází s cílem dalšího snížení matriční interference. Díky vyspělé automatizaci 2D-LC je možné rozšířit přístup na další třídy látek (drogy, léky) a miniaturizovat systémy pro vyšší propustnost vzorků a nižší spotřebu rozpouštědel.

Závěr

Implementace dvoudimenzionální LC/MS/MS se srdečním výřezem výrazně snižuje ionizační supresi u kanabinoidů v krevní plasmě a umožňuje spolehlivou kvantifikaci THC, THC-OH i THC-COOH při minimální přípravě vzorku. Metoda prokázala vysokou citlivost, linearitu a reprodukovatelnost vhodnou pro forenzní aplikace.

Reference

1. Hädener M.; et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2016, 408, 1953–1962.
2. Desrosiers N.; et al. Journal of Analytical Toxicology 2015, 39, 251–261.
3. Crifasi J.; Honnold R.; Kubas R. Agilent Technologies Application Note 5991-1609EN, 2012.
4. Van Damme P.; et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2014, 406, 401–407.