Quantitation of the Chiral Shift in Metabolism of Propranolol Using 2D-LC/MS/MS

Význam tématu

Enantiomery chirálních léčiv vykazují rozdílné farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti. Propranolol a jeho hydroxylované metabolity jsou významným příkladem, kde selektivní rozlišení R a S formy napomáhá lepšímu pochopení enantioselektivní metabolizace a vylučování u lidí.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo kvantitativně sledovat chiralitu propranololu a jeho hydroxy metabolitů v lidském moči po podání racemické směsi. Použit byl online 2D-LC/MS/MS přístup kombinující achirální první dimenzi a chirální druhou dimenzi bez nutnosti frakčního sběru.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC System: dva vysokotlaké pumpy, dvě termostaty, dva ventily s modulací, multisampler s chlazením
• Chromatografické kolony: Poroshell 120 Phenyl-Hexyl (2.1×100 mm, 2.7 µm) a Poroshell 120 Chiral-T (4.6×100 mm, 2.7 µm)
• Agilent 6495 triple quadrupole LC/MS s Jet Stream ESI zdrojem
• Software: OpenLab CDS ChemStation, MassHunter Workstation (Data Acquisition, Quantitative Analysis), 2D Chromatogram Creator

Použitá metodika

Vzorky moči se ředily metanolem, centrifugovaly a aplikovaly do 2D-LC. První dimenze s gradientem na achirální kolóně vyčlenila pěti minutové eluční pásma cílových sloučenin. Srdcová sekce byla přepnuta na druhou dimenzi s chirální kolónou, kde proběhlo enantiomerické rozlišení. Detekce probíhala současně UV při 230 a 290 nm a MS v MRM módu s charakteristickými přechody pro propranolol a hydroxy sloučeniny.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda zajistila baseline oddělení enantiomerů pro propranolol a tři ring-hydroxylované metabolity s rozlišením Rs 2.4 až 3.1 během jednoho běhu. Retenční časy byly vysoce stabilní (RSD ≤ 0.11 %). Matricky kalibrované křivky vykazovaly koeficient determinace nad 0.97, LOD v rozmezí 8–47 pg/mL a LOQ 48–265 pg/mL. V moči sledované po 5,1 hodinách se prokázaly výrazné enantiomerní posuny v exkreci: (S)-enantiomer propranololu dominoval s poměrem S/R až 2,4, zatímco hydroxymetabolity vykazovaly nižší poměry (S/R < 0.13 pro 5-HOPL a 7-HOPL). Maximální vylučovací rychlost propranololu dosáhla 281 ng/min pro (S) formu a 237 ng/min pro (R) formu.

Přínosy a praktické využití metody

Online 2D-LC/MS/MS významně zkracuje dobu analýzy a eliminuje manuální manipulaci s frakcemi. Metoda umožňuje spolehlivý profiling enantiomerů i při nízkých koncentracích v biologických matricích a poskytuje data využitelná ve farmakokinetických studiích i v regulovaných QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření 2D-LC přístupu na další chirální farmakologické sloučeniny a jejich metabolity
• Automatizace přípravy vzorků a integrované datové workflow pro vysokoprůtokové studie
• Využití HRMS pro doplnění kvantitativních dat o strukturní informace v reálném čase

Závěr

Vyvinutá online 2D-LC/MS/MS metoda pro propranolol a jeho hydroxy metabolity nabízí efektivní enantiomerické rozlišení, vysokou citlivost a reprodukovatelnost. Umožňuje detailní sledování enantioselektivní metabolizace v lidské moči s potenciálem pro široké farmakometabolomické aplikace.

Reference

1. EMA. Investigation of Chiral Active Substances, 1993.
2. FDA. Development of New Stereoisomeric Drug, 1992.
3. Woiwode U. et al. Enantioselective Multiple Heartcut Two-Dimensional Ultra-High-Performance Liquid Chromatography Method With a Coreshell Chiral Stationary Phase in the Second Dimension for Analysis of All Proteinogenic Amino Acids in a Single Run. Journal of Chromatography A, 2018, 1562, 69–77.
4. Joseph S., Subramanian M., Khera S. Simultaneous and Stereospecific Analysis of Warfarin Oxidative Metabolism Using 2D LC/Q-TOF. Bioanalysis, 2015, 7, 2297–2309.
5. Harps L.C. et al. Two Dimensional Chromatography Mass Spectrometry: Quantitation of Chiral Shifts in Metabolism of Propranolol in Bioanalysis. Journal of Chromatography A, 2019, in press.
6. Bichara N. et al. Propranolol Hydroxylation and N-Desisopropylation by Cytochrome P4502D6: Studies Using the Yeast-Expressed Enzyme and NADPH/O2 and Cumene Hydroperoxide-Supported Reactions. Drug Metabolism and Disposition, 1996, 24, 112–118.
7. Yoshimoto K. et al. Identification of Human CYP Isoforms Involved in the Metabolism of Propranolol Enantiomers—N-Desisopropylation Is Mediated Mainly by CYP1A2. British Journal of Clinical Pharmacology, 1995, 39, 421–431.
8. Masubuchi Y. et al. Cytochrome P450 Isozymes Involved in Propranolol Metabolism in Human Liver Microsomes. Drug Metabolism and Disposition, 1994, 22, 909–915.
9. Narimatsu S. et al. Species Difference in Enantioselectivity for The Oxidation of Propranolol by Cytochrome P450 2D Enzymes. Chemico-Biological Interactions, 2000, 127, 73–90.
10. Gu H. Selecting the Correct Weighting Factors for Linear and Quadratic Calibration Curves with Least-Squares Regression Algorithm in Bioanalytical LCMS/MS Assays and Impacts of Using Incorrect Weighting Factors on Curve Stability, Data Quality, and Assay Performance. Analytical Chemistry, 2014, 86, 8959–8966.