In-depth Peptide Mapping with Iterative MS/MS Acquisition on the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF

Význam tématu

Analýza terapeutických monoklonálních protilátek vyžaduje detailní charakterizaci jejich primární sekvence a posttranslačních modifikací. Peptidové mapování pomocí LC/MS patří k nejdůležitějším nástrojům v biologické analytice, protože umožňuje potvrdit sekvenci a kvantifikovat modifikace jako deamidace, oxidace či glykozylace. Precizní identifikace i stopových forem peptidů je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři prezentují integrovaný workflow pro hloubkové peptidové mapování monoklonální protilátky. Proces zahrnuje automatizovanou přípravu vzorku, chromatografickou separaci, hmotnostní spektrometrii s iterativní selekcí pro fragmentaci a sofistikovaný software pro zpracování dat. Cílem bylo zvýšit pokrytí sekvence, zlepšit detekci nízce koncentrovaných peptidů a detailně charakterizovat posttranslační modifikace.

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo – autosamplovací robot pro redukci, alkylaci, tryptická štěpení a desalting
• Agilent 1290 Infinity II LC systém s AdvanceBio Peptide Mapping kolonkou (2,1×150 mm, 2,7 µm)
• Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF s Dual Jet Stream ESI zdrojem
• Agilent MassHunter BioConfirm B.09 software pro automatizované zpracování hmotových dat

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek lidské IgG1 byl redukován, alkylován a digesován trypsinem na robotické platformě AssayMAP. Separace probíhala při 60 °C s gradienty 15 nebo 30 minut (0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě/acetonitrilu) s průtokem 0,4 mL/min. MS parametry: rozsah m/z 110–1700, automatický výběr až 10 prekurzorů na cyklus, ExDR režim, iterativní MS/MS s dynamickým vylučováním dříve fragmentovaných iontů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Při injekci 0,6 µg a 15min gradientu dosáhl systém >96 % pokrytí sekvence těžkého a >98 % lehkého řetězce. Vynechané sekvence doplnila druhá analýza iterativním MS/MS, čímž se pokrytí zvýšilo na 100 % pro oba řetězce.
• Iterativní MS/MS výrazně zlepšila identifikaci nízkokoncentrovaných peptidů, např. glykozylovaný peptide TKPREEQYNSTYR byl detekován až ve druhém cyklu.
• Detailní PTM analýza peptidu NTAYLQMNSLR odhalila a kvantifikovala formy oxidace (M7, 2,8 %), deamidace N1 (1,03 %), N8 (1,50 % a 0,44 %), dvojitou deamidaci Q6N8 (0,16 %) i možné isomerizace Asp.
• Snímky ECC a MS/MS spekter potvrdily kvalitu identifikace i u nízkho procenta modifikovaných forem nad úrovní 0,1 %.

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný přístup umožňuje vysoce citlivé peptidové mapování s plným pokrytím sekvence i stopových PTM forem. Automated sample prep a iterativní akvizice zkracují dobu analýz, zvyšují reprodukovatelnost a spolehlivost výsledků. Metoda je vhodná pro fáze vývoje, výroby i kontroly kvality bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace a integrace s AI pro predikci a anotaci modifikací
• Zvýšení propustnosti pomocí paralelních LC/MS modulů
• Rozšíření o iontovou mobilitu a vysokorozlišující MS pro detekci komplexních PTM
• Pokročilé bioinformatické nástroje pro rychlou validaci a kvantifikaci

Závěr

Prezentovaný workflow spojuje plně automatizovanou přípravu vzorků, vysoce výkonnou LC/Q-TOF akvizici s iterativní MS/MS a pokročilou datovou analýzu. Výsledkem je komplexní peptidová mapa s vysokým pokrytím a citlivou detekcí modifikací až do 0,1 %, což významně podporuje charakterizaci a kvalitu bioterapeutik.

Reference

1. Automation for LC/MS Sample Preparation: High Throughput In-Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform, Agilent Technologies, 5991-2957EN
2. An Integrated Workflow for Peptide Mapping of Monoclonal Antibodies, Agilent Technologies, 5991-7811EN
3. Automation of Sample Preparation for Accurate and Scalable Quantification and Characterization of Biotherapeutic Proteins Using the Agilent AssayMAP Bravo Platform, Agilent Technologies, 5991-4872EN
4. Yang H.; Zubarev R. A. Mass spectrometric analysis of asparagine deamidation and aspartate isomerization in polypeptides. Electrophoresis 2010, 31(11), 1764–1772