High-Throughput MS Detection of Histone H3 Demethylation by Lysine-Specific Demethylase 1 (LSD1)

Význam tématu

Epigenetické modifikace histonů hrají klíčovou roli v regulaci genové exprese a jsou spojeny s řadou onemocnění, včetně rakoviny či neurodegenerativních chorob. Sledování aktivity demethylas LSD1 (lysine-specific demethylase 1) přináší cenné informace o dynamice odstraňování methylových skupin z lysinů na histonu H3, což je nezbytné pro pochopení a cílený zásah v epigenetice. Vysoce propustné (high-throughput) metody s hmotnostní spektrometrií umožňují rychlou a přesnou kvantifikaci různých modifikačních stavů bez potřeby značených substrátů nebo radioaktivity.

Cíle a přehled studie

Studie ukazuje aplikaci systému Agilent RapidFire spojeného s hmotnostní spektrometrií (RapidFire/MS) pro rychlou a přímou analýzu demethylace histonu H3 enzymem LSD1. Hlavní cíle byly:

• Demonstrace sekvenčního odstraňování methylových skupin z H3K4me2 na H3K4me1 a H3K4me0.
• Určení kinetických parametrů (Km) pro substrát H3K4me2.
• Stanovení inhibičního účinku tranylcyprominu na LSD1 a výpočet IC50.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická metoda spočívá v online přípravě vzorku a rychlém (cca 7 s na vzorek) transportu do hmotnostního spektrometru. Použité kroky zahrnovaly:

• Inkubaci histonového peptidu s LSD1 za stanovených podmínek.
• RapidFire desorpci a přenos do MS pro záznam masových signálů všech methylovaných forem současně.
• Kvantifikaci relativních poměrů H3K4me2, H3K4me1 a H3K4me0 v čase.

Hlavní výsledky a diskuse

Experimenty potvrdily sériové demethylování: konzistentní nárůst H3K4me1 a následně H3K4me0 při poklesu H3K4me2. Kinetické studie prokázaly lineární počáteční rychlosti a umožnily stanovit Michaelisovu konstantu Km ≈ 3,5 µM, která je ve shodě s literaturou. Inhibiční test tranylcyprominem ukázal hodnotu IC50 ≈ 54 µM, rovněž odpovídající dříve publikovaným datům.

Přínosy a praktické využití metody

RapidFire/MS nabízí:

• Label-free přímou detekci více modifikačních stavů současně.
• Vysokou propustnost umožňující screening stovek až tisíců vzorků denně.
• Vynechání radioaktivních nebo fluoroiontových značek, což zjednodušuje přípravu a snižuje náklady i bezpečnostní rizika.

Budoucí trendy a možnosti využití

Využití rychlých hmotnostních spektrometrických platforem se očekává v:

• Vývoji inhibitorů epigenetických enzymů pro farmaceutický výzkum.
• Detailním mapování dynamiky histonových modifikací v buněčných modelech.
• Personalizované medicíně – screening biomarkerů epigenetických změn u pacientů.

Závěr

Systém RapidFire/MS prokázal schopnost spolehlivě a efektivně sledovat demethylaci histonu H3 enzymem LSD1 v high-throughput režimu. Metoda poskytuje přesné kinetické parametry i inhibiční data, přičemž eliminuje potřebu označování substrátů. Díky tomu je ideální pro farmaceutický screening a epigenetický výzkum.

Použitá instrumentace

• Agilent RapidFire platforma pro online přípravu vzorku.
• Hmotnostní spektrometrie pro detekci a kvantifikaci modifikačních stavů.

Reference

1. Rye PT et al. Advances in Label-Free Screening Approaches for Studying Sirtuin-Mediated Deacetylation. J Biomol Screen., 2011.
2. Rye PT et al. Advances in Label-Free Screening Approaches for Studying Histone Acetyltransferases. J Biomol Screen., 2011.
3. Forneris F et al. Human Histone Demethylase LSD1 Reads the Histone Code. J Biol Chem., 2005, 280(50):41360–41365.
4. Caliper Life Sciences. LabChip Assay: Histone H3 Demethylase LSD1. Application Note #302.