Ultrafast Histone Deacetylase Selectivity Screening Using the Agilent RapidFire High-Throughput Mass Spectrometry System

Význam tématu

Screening selektivity inhibitorů histonových deacetyláz (HDAC) je klíčovým krokem ve vývoji léčiv, protože pomáhá vyloučit sloučeniny s nežádoucími vedlejšími účinky na ostatní izoformy. Tradiční optické metody často trpí interferencemi, zatímco hmotnostní spektrometrie (MS) nabízí vyšší spolehlivost a přesnost. Hlavní překážkou využití MS v HTS je však pomalý stupeň vzorkové přípravy a separace.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo ověřit využitelnost systému Agilent RapidFire pro výrazné zrychlení MS-based selektivního screeningu čtyř HDAC izoform (SIRT1, SIRT3, HDAC1, HDAC6) a porovnat tradiční individuální analýzy s multiplexním formátem. Studie demonstrovala, že multiplexní SPE-MS/MS dosahuje rychlosti až ~3 sekundy na vzorek bez ztráty kvality dat.

Použitá metodika

Pro každou izoformu byly připraveny fluorescenčně neoznačené peptidové substráty reprezentující části p53 nebo histonu H4. Reakce probíhaly při optimálních pH a iontové síle, u SIRT reakcí s NAD+ a ukončovány kyselinou mravenčí. Bylo stanoveno Km a IC50 pro referenční inhibitory. Analýzy se prováděly jak jednotlivě, tak vzorky group-pooled v multiplexu.

Použitá instrumentace

Agilent RapidFire 365 SPE modul propojený s Agilent 6490 iFunnel Triple Quadrupole MS v pozitivním ionizačním režimu. Použito bylo Agilent MassHunter Acquisition pro sběr dat a MassHunter Qualitative pro jejich vyhodnocení.

Hlavní výsledky a diskuse

Multiplexní analýza umožnila sběr dat rychlostí ~3 s/vzorek oproti 12 s/vzorek v individuálním režimu. Km hodnoty získané oběma formáty se shodovaly do 2násobku a IC50 křivky referenčních inhibitorů vykazovaly statisticky nerozlišitelné výsledky v multiplexu i při samostatných měřeních. Příklad isoformně selektivního inhibičního testu tubacinem proti HDAC6 demonstroval jasné rozdíly v potenční aktivitě napříč čtyřmi enzymy během méně než 5 minut pro 96 vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazně vyšší throughput MS-screeningu srovnatelný s optickými metodami.
• Bez nutnosti značení substrátů, nižší umělé interference.
• Schopnost robustně a rychle generovat tisíce datových bodů během pracovní směny.
• Usnadnění rychlého selekčního profilu nových inhibitorů v preklinikální fázi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Multiplexní SPE-MS/MS lze rozšířit na další třídy enzymů (kinázy, hydrolázy) a kombinovat s robotizovanými platformami pro plně automatizovaný HTS. Další integrace s pokročilou datovou analýzou a strojovým učením umožní prediktivní optimalizaci sloučenin a real-time monitorování kinetiky biochemických reakcí.

Závěr

Použití Agilent RapidFire systému pro SPE-MS/MS výrazně eliminuje časovou bariéru v HTS selektivity HDAC izoform. Multiplexní analýza dosahuje srovnatelné kvality dat jako individuální měření, ale až čtyřnásobně rychlejší. Tento přístup přináší MS-kvalitní data v rozsahu tisíců vzorků za den, čímž se stává konkurenceschopným vůči optickým screeningovým metodám.

Reference

• Regna NL, Reilly CM. Isoform-Selective HDAC Inhibition in Autoimmune Disease. J. Clin. Cell. Immunol. 2014, 5:207.