A study of SIRT1- and SIRT2‑Mediated Deacetylation

Význam tématu

Post-translační modifikace lysinových reziduí, zejména deacetylace katalyzovaná sirtuiny, reguluje klíčové biologické procesy včetně zánětu, metabolismu, proliferace a neurodegenerativních onemocnění. Vysokopropustné a bezštítkové metody pro monitoring těchto enzymů jsou proto nezbytné pro vývoj léčiv a biochemické výzkumy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat využití systému Agilent RapidFire pro vysokopropustnou hmotnostní spektrometrii (MS) při screeningu a kinetické charakterizaci enzymů SIRT1 a SIRT2. Autoři sledovali lineární konverzní oblasti, hodnoty vazebných konstant a IC50 pro inhibici nicotinamidem. Dále bylo možné sledovat postupné deacetylace triply-acetylovaného p53 peptidu.

Použitá metodika a instrumentace

Systém: Agilent RapidFire high-throughput MS (ESI/MS/MS, pozitivní ionizační mód)

Reagencie:

• Rekombinantní SIRT1 a SIRT2 (BlueSky Biotech), skladované při –80 °C
• Acetylované p53 peptidy (monacetylovaný i triply-acetylovaný)
• Buffer reakce: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.05 % BSA, NAD+ 250 μM

RapidFire pufry a parametry:

• Buffer A: voda + 0.09 % kys. mravenčí + 0.01 % TFA, 1.5 mL/min
• Buffer B: 80 % acetonitril + 0.09 % kys. mravenčí + 0.01 % TFA, 1.25 mL/min
• Cartridge: typ A
• MRM přechody: 534.4/128.6 (1ac), 523.9/128.6 (0ac), 555.5/638.6 (3ac), 545.0/624.6 (2ac) apod.

Hlavní výsledky a diskuse

SIRT1: Enzymová titrace prokázala lineární tvorbu deacetylovaného produktu (R2=0.9942). Km pro monacetylovaný p53 byl 25 μM a IC50 nicotinamidu 62 μM, v souladu s literaturou.
Postupná deacetylace triply-acetylovaného p53 peptidu od 3ac→2ac→1ac→0ac byla měřena paralelně, což zdůrazňuje výhodu MS detekce pro rozlišení jednotlivých modifikovaných forem.
SIRT2: Podobná charakterizace prokázala lineární kinetiku (R2=0.9971), Km 8 μM a IC50 nicotinamidu 11 μM, blízko dříve publikovaným hodnotám.

Přínosy a praktické využití metody

Label-free vysokopropustná MS analýza eliminuje potřebu značených substrátů a sekundárních reakcí, čímž se zjednodušuje příprava a interpretace dat. Schopnost sledovat více stavů deacetylace současně poskytuje komplexní pohled na enzymové mechanismy a podporuje vývoj robustních screeningových protokolů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření přístupu na další deacetylázy a epigenetické enzymy, integrace s plně automatizovanými screeningovými platformami, aplikace ve vysoce propustném farmaceutickém výzkumu a personalizovaném testování inhibitorů. Kombinace s dalšími MS metodami pro hlubší charakterizaci modifikačních sítí.

Závěr

Agilent RapidFire high-throughput MS systém poskytuje rychlou, citlivou a spolehlivou metodu pro kinetiku a inhibici sirtuinů bez štítkovaných substrátů. Přesné stanovení Km a IC50 usnadňuje vývoj screeningu pro objev nových modulátorů enzymů.

Reference

• Yamamoto H., Schoonjans K., Auwerx J. Sirtuin Functions in Health and Disease. Mol. Endocrinol. 2007 Aug;21(8):1745–55.
• Porcu M., Chiarugi A. The Emerging Therapeutic Potential of Sirtuin-Interacting Drugs: from Cell Death to Lifespan Extension. Trends Pharmacol. Sci. 2005 Feb;26(2):94–103.
• Marcotte P.A. et al. Fluorescence Assay of SIRT Protein Deacetylases Using an Acetylated Peptide Substrate and a Secondary Trypsin Reaction. Anal. Biochem. 2004 Sep 1;332(1):90–9.