Quantitative analysis of anabolic steroids in control samples from food-producing animals using a column-switching LC-HESI-MS/MS assay

Význam tématu

Použití anabolických steroidů u zvířat určených pro potravinářské účely je zakázáno evropskou legislativou kvůli riziku reziduí hormonů v potravinách. Pro zajištění bezpečnosti spotřebitelů je třeba rychlých, citlivých a selektivních metod pro detekci a kvantifikaci těchto látek v biologických matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout metodu online-SPE spojenou s LC-HESI-MS/MS pro kvantitativní analýzu osmi anabolických steroidů v moči skotu. Metoda má nahradit časově náročné dvoustupňové offline SPE, snížit dobu přípravy vzorku, minimalizovat iontové potlačení a isobarické interference.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky bovinní moči byly nejprve odcentrifugovány a podrobeny enzymatické hydrolýze β-glukuronidázou při 37 °C po dobu 6 hodin. K přípravě se přidávaly deuterované interní standardy.
Online-SPE probíhalo pomocí šestipozičního ventilu a pasty EXP Trap C8 (1 × 5 mm), odkud byly analyty zpětně splachovány na Chromolith Fast Gradient monolitickou kolonu RP-18e (50 × 2 mm) při průtoku 0,4 mL/min a teplotě 40 °C.
Chromatografie probíhala na UHPLC systému Nexera, detekce na triplekvadruplu Shimadzu LCMS-8050 s ohřátým ESI (HESI). Metoda pracovala v MRM módu v pozitivním i negativním ionizačním režimu. Mobilní fáze tvořila voda a methanol, oba s 0,2 mM fluoridem amonným, pro lepší citlivost.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla mez detekce (LOQ) nižší než 0,25 pg/μL pro všechny analyty. Linearita v rozsahu 0,25–6 pg/μL byla vynikající (R²>0,998). Intradenní opakovatelnost RSD byla pod 4,6 % při 2 pg/μL a pod 3,6 % při 6 pg/μL. Matriční efekty byly významné, potlačení signálu dosahovalo až 90 % u dienestrolu a 68 % u hydroxystanozololu, proto byly použity izotopové interní standardy pro kompenzaci.
Optimalizace mobilních fází prokázala lepší odezvu při použití fluoridu amonného oproti hydroxidu amonnému. Vícenásobné nanoinjekce na pastu (3×5 μL) významně zvýšily citlivost oproti jediné větší injekci.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby preanalytické přípravy vzorku
• Eliminace dvoustupňového offline SPE
• Vysoká citlivost a selektivita pro nízké koncentrace steroidů
• Vhodné pro rutinní monitoring reziduí v potravinové bezpečnosti

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody na další třídy léčiv a metabolitů, další biologické matrice (mléko, maso, krmiva) a integrace s vysoce přesnou hmotnostní spektrometrií (HRMS) pro screening neznámých sloučenin. Dále je perspektivní automatizace a miniaturizace preanalytických kroků pro vyšší průtok vzorků.

Závěr

Vyvinutá online-SPE-LC-HESI-MS/MS metoda umožňuje rychlou, citlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci osmi anabolických steroidů v moči bovin pod požadovanými STC hladinami. Metoda významně urychluje analýzu a splňuje legislativní požadavky na kontrolu reziduí hormonů v potravinách.

Reference

• Baker DR, Warrander J, Loftus N, Hird S. Quantitative analysis of anabolic steroids in control samples from food-producing animals using a column-switching LC-HESI-MS/MS assay. ASMS 2014; TP285.