Automated Determination of Steroids in Urine of Food-Producing Animals

Význam tématu

V Evropské unii je zakázáno používání steroidů k podporování růstu hospodářských zvířat. Pravidelné sledování obsahu syntetických a endogenně vznikajících steroidů v moči je klíčové pro vynucení legislativy a zajištění bezpečnosti potravin. Laboratoře provádějící stovky až tisíce analýz ročně potřebují efektivní a reprodukovatelnou přípravu vzorků, kterou umožňuje automatizace.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout a validovat automatizovaný postup dvojnásobné SPE extrakce moči na systému FREESTYLE SPE a porovnat jej s manuální metodou. Studie popisuje přípravu vzorků, chromatografická stanovení a vyhodnocení výtěžnosti a reprodukovatelnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek moči je centrifugován, naředěn pufrem s glukuronidázou/arylsulfatázou a inkubován při 37 °C přes noc. Po odstředění následuje dvojnásobná SPE extrakce: první kolonka HR-X, druhá NH2 na odstraňování interferencí. Postup je realizován ručně i automaticky na FREESTYLE SPE (moduly pro dodávku rozpouštědel, nosiče kolonek, znovupoužitelné písty). Suchá koncetrace pomocí TurboVap a následná resolubilizace ve formiátovém elučním pufru umožňují připravit extrakt pro HPLC-MS/MS.
Instrumentace:

• Automatizace FREESTYLE SPE Basic se SPE modulem a softwarem
• HPLC-MS/MS Agilent 1290 Infinity Quat. Pump + 6495, ESI pozitivní ionizace
• Kolona Phenomenex Luna C18(2) 150×2,0 mm, gradient 10–93 % A/B, 20 min, 0,2 mL/min

Hlavní výsledky a diskuse

Pro všechny cílové steroidy (boldenon, nortestosteron, trenbolon, methyltestosteron, stanozolol, ethinylestradiol) byly dosaženy recoveries v rozmezí -50 až +20 % při koncentracích pod 1 μg/kg, splňující rozhodnutí 2002/657/EG. Reprodukovatelnost interních standardů ukázala u automatizované přípravy RSD 16–21 %, u manuální 22–39 %. Výsledky potvrzují srovnatelnou nebo mírně lepší přesnost a opakovatelnost u robotické extrakce.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace dvojnásobné SPE výrazně zkracuje čas přípravy, snižuje pracovní zatížení obsluhy a minimalizuje chyby při manipulaci. Metoda je vhodná pro rutinní monitoring stovek vzorků měsíčně v oficiálních a komerčních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v oblasti HRMS pro širší profilaci anabolik, miniaturizaci SPE kartridží a integraci datové analýzy umělou inteligencí pro rychlou detekci neznámých metabolit. Multiplexní postupy a on-line SPE-LC-MS budou zvyšovat citlivost a throughput.

Závěr

Automatizovaný postup dvojnásobné SPE na systému FREESTYLE SPE pro stanovení steroidů v moči hospodářských zvířat dosahuje požadovaných výtěžností i reprodukovatelnosti. Robotická příprava je doporučena pro vysokoprůchodové laboratoře s nároky na stabilitu výsledků.

Reference

• Confirmatory Method for the Determination of Steroids in Bovine Urine by LC-MS/MS; Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2011
• Polemans S., De Wasch K., Noppe H. a kol.: Endogenous occurence of some anabolic steroids in swine matrices; Food Additives and Contaminants, 2005, 22(9):808–815