Measurement of Methylmalonic Acid, 3-OH Propionic Acid and Succinic Acid in DBS (Dried Blood Spot) with LCMS-8040

Význam tématu

Metabolity methylmalonové kyseliny, 3-hydroxypropionové kyseliny a sukcinové kyseliny představují klíčové biomarkery aktivity enzymů methylmalonyl-CoA mutázy a propionyl-CoA karboxylázy. Jejich stanovení v sušených kapkách krve (DBS) umožňuje efektivní novorozenecký screening i sledování dědičných metabolických poruch, minimalizuje objem vzorku a zrychluje laboratorní diagnostiku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo popsat a ověřit LC-MS/MS protokol používaný v laboratoři Meyer Children’s Hospital pro kvantifikaci methylmalonové kyseliny (MMA), 3-OH propionové kyseliny (3-OH PA) a sukcinové kyseliny (SA) v DBS, plazmě a moči. Metoda hodnotila přesnost, citlivost a schopnost eliminovat falešně pozitivní výsledky při rozšířeném novorozeneckém screeningu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: 3,2mm disk DBS extrahovaný 200µl roztoku 0,05% HCOOH v H2O/MeCN (30/70) s interním standardem 13C-MMA (d3-MMA). Po 25min inkubaci při 37°C a centrifugaci byla supernatant přenesena k analýze.
Chromatografie:

• Kolona: Gemini C6-Phenyl (100×2,0mm, 3µm); teplota 30°C.
• Mobilní fáze A: 0,1% HCOOH/H2O; B: 0,1% HCOOH/MeCN; 60% fáze B, průtok 0,2ml/min; doba běhu 5 min.
• Injekční objem: 5µl.

Hmotnostní spektrometrie:

• Přístroj: Shimadzu LCMS-8040 (triple kvadrupól, ESI+).
• Napětí sondy: +4,5kV; teplota DL 250°C; blok 400°C; průtoky dusíku: nebulizace 2,5l/min, sušení 15l/min.
• MRM přechody: SA 116,9>73,2; MMA 116,9>73,1; d3-MMA 119,9>76,1; LA/3-OH PA 89>58,9.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy ukázaly rozdílné profily ve vzorcích Sample A (normální enzymatická aktivita): detekce MMA, 3-OH PA, SA a interního standardu; Sample B (negativní mutáza): pouze 3-OH PA a SA; kontrola („Normal“) vykázala přítomnost všech analyzovaných kyselin. Oddělení propionové a mléčné kyseliny prokázalo dostatečný rozlišovací výkon i při stejných MRM přechodech.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé druhotné vyšetření novorozeneckých vyšetření s nižším počtem falešně pozitivních výsledků. Výhodou je malý objem DBS, zkrácení doby přípravy vzorku a kompatibilita s existujícími screeningovými programy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dalšího spektra metabolit pro rozšířený metabolický profil.
• Automatizace přípravy vzorků a vysokopropustné (high-throughput) platformy.
• Validace metody pro klinickou diagnostiku a personalized medicine.

Závěr

Popisovaná LC-MS/MS metoda na přístroji Shimadzu LCMS-8040 nabízí vysoce citlivé, specifické a časově úsporné stanovení klíčových metabolit v DBS, plazmě a moči. Díky jednorozběhové analýze a robustním MRM přechodům se jedná o spolehlivý nástroj pro screening i rozšířená vyšetření metabolických poruch.

Reference

• la Marca G, et al. Progress in expanded newborn screening for metabolic conditions by LC-MS/MS in Tuscany: Update on methods to reduce false positive. JIMD Short report #127 (2008)
• la Marca G, et al. Rapid 2nd-Tier Test for Measurement of 3-OH-Propionic and Methylmalonic Acids on Dried Blood Spots: Reducing the False-Positive Rate for Propionylcarnitine during Expanded Newborn Screening by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry 53:1364–1369 (2007)