Rapid Analysis of Immuno-suppressants Using Triple Quadrupole LC-MS/MS

Význam tématu

Rychlé a přesné stanovení imunosupresiv je zásadní pro optimalizaci léčby pacientů po transplantaci a pro kontrolu kvality farmaceutických přípravků. Ultrarychlé chromatograficko-hmotnostní metody umožňují zvýšit denní kapacitu analýz a snížit spotřebu reagencií, přičemž zachovávají vysokou citlivost a selektivitu.

Cíle a přehled studie

Studie popisuje vývoj a validaci LC-MS/MS metody pro simultánní kvantifikaci čtyř klíčových imunosupresiv (tacrolimus, everolimus, rapamycin, cyklosporin A) za přítomnosti dvou interních standardů (askomycin, cyklosporin D). Hlavním cílem bylo dosáhnout analýzy v čase kratším než 120 sekund bez kompromisu na analytické výkonnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografická jednotka Nexera X2 s kolonnou YMC-Triart C18 (30 × 2 mm i.d., 1,9 µm) pracovala při 65 °C s mobilem A (1 mmol/l acetát amonný ve vodě) a mobilem B (1 mmol/l acetát amonný v methanolu). Gradientní program začínal na 60 % B, během 0,1 min přešel na 75 % B, následně do 0,7 min na 95 % B a do 0,9 min se držel, poté se do 1,8 min vrátil na 60 % B. Průtok činil 0,45 ml/min, injekční objem 1,5 µl.
Hmotnostní spektrometrie byla provozována na LCMS-8050 (Shimadzu) v režimu ESI negative. Podmínky:

• Applied voltage: –4,5 až –3,0 kV
• Nebulizer gas: 3,0 l/min, drying gas: 5,0 l/min, heating gas: 15,0 l/min
• Interface temp.: 400 °C, DL temp.: 150 °C, heat block: 390 °C
• MRM přechody selektovány pro každý analyte a interní standard

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje limity kvantifikace 1 ng/ml pro všechny analyty při nízkém injekčním objemu. Kalibrační linearita byla pro tacrolimus 0,5–500 ng/ml, everolimus 0,2–200 ng/ml, rapamycin 0,5–500 ng/ml a cyklosporin A 0,2–1000 ng/ml. Přesnost v terapeutickém rozmezí se pohybovala mezi 85–115 % a opakovatelnost (RSD) pod 20 % na nejnižší úrovni kalibrace. Celková délka běhu 1,8 min zajišťuje vysokou kapacitu analýz (>30 vzorků za hodinu).

Přínosy a praktické využití metody

Ultrarychlá analýza významně zkracuje dobu odezvy v klinické farmakokinetice a zvyšuje propustnost rutiních laboratoří. Nízká spotřeba mobilních fází snižuje provozní náklady a ekologickou zátěž. Metoda je vhodná pro monitorování léčebných dávek u transplantovaných pacientů a pro kontrolu kvality farmaceutických formulací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkracování analýz díky microflow-LC, novým materiálům kolonn a pokročilým detekčním systémům. Integrace automatizované přípravy vzorků a online vzorkového čištění (SPE) může zvýšit robustnost a propustnost. Multiplexní přístupy a kombinace s jinými technikami (ion mobility, HRMS) rozšíří schopnost simultánního sledování většího počtu analytů.

Závěr

Popsaná UHPLC-MS/MS metoda poskytuje robustní, citlivý a vysoce efektivní nástroj pro stanovení imunosupresiv v klinickém i farmaceutickém prostředí. Díky ultrarychlému režimu a nízké spotřebě reagencií se jedná o perspektivní postup pro rutinní i výzkumné aplikace.