Accelerated and robust monitoring for immunosuppressants using triple quadrupole mass spectrometry

Význam tématu

Imunosupresiva jsou klíčová pro prevenci odmítnutí transplantovaných orgánů a léčbu autoimunitních onemocnění. Přesné sledování jejich koncentrace v krevním séru zabraňuje poddávkování i naddávkování, čímž minimalizuje riziko odmítnutí štěpu či imunosuprese.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl vyvinout vysoce produktivní a spolehlivou metodu pro souběžné stanovení čtyř imunosupresiv (takrolimus, rapamycin, everolimus a cyklosporin A) za použití dvou interních standardů (askomycin a cyklosporin D). Analýza má proběhnout během jedné běžné doby menší než 2 minuty při zachování citlivosti a přesnosti.

Použitá metodika

Extrahovalo se 2,7 mL plné krve přidáním vody a organického rozpouštědla (MTBE/cyklohexan), následovalo centrifugování, oddělení organické fáze, nízkotlaké sušení pod dusíkem a rekonstituce v methanolovém roztoku s amonnou solí. Po filtrace se vzorky aplikovaly na LC–MS systém.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Shimadzu Nexera s kolonou YMC-Triart C18 (30 mm × 2 mm, 1,9 μm), gradient 60–95 % methanolu v 1 mmol/L amonném acetátu, tepelný gradient od 0 do 1,8 min, průtok 0,45 mL/min, teplota kolony 65 °C, injekce 1,5 μL.
• MS: Shimadzu LCMS-8050, ESI v negativním módu, iontové přechody MRM optimalizované pro deprotonované ionty všech analytů i interních standardů.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila separaci a detekci všech čtyř imunosupresiv do 1,8 min. LLOQ dosáhlo 0,5 ng/mL pro každý analyte, dynamický rozsah až do 1000 ng/mL. Přesnost stanovení se pohybovala mezi 88 a 110 %, opakovatelnost (CV) byla pod 20 % i na nejnižší úrovni kalibrace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza (< 2 min) umožňuje vysokou propustnost vzorků v klinických laboratořích.
• Negativní ionizace zajišťuje robustní a spolehlivou kvantifikaci bez interference aduktů.
• Minimální spotřeba vzorku (1,5 µL) a nízké LLOQ vhodné i pro monitoring pacientů s nízkými koncentracemi léků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody o další terapeutická a biologická činidla pro multiplexní analýzy.
• Automatizace předúprav vzorků a integrace s informačními systémy laboratoří pro vyšší efektivitu workflow.
• Využití ultra-rychlých MS systémů pro point-of-care diagnostiku a personalizovanou medicínu.

Závěr

Vyvinutá metoda pro kvantifikaci čtyř imunosupresiv pomocí LC–MS/MS v negativním módu prokázala vysokou rychlost, citlivost a spolehlivost. Shimadzu Nexera spojená s LCMS-8050 umožňuje robustní rutinní monitoring léků v krevním séru v čase pod 2 minuty.