Analysis of Peptone Samples Using the Agilent InfinityLab 2D‑LC Solutions with Active Solvent Modulation

Význam tématu

Peptony představují vodou rozpustné směsi peptidů a aminokyselin používané jako živiny pro kultivaci buněk a výrobu rekombinantních proteinů. Díky enzymatické či acidické hydrolýze surovin (např. kasein, sója) dochází k výrazné variabilitě šarží, což ovlivňuje výtěžnost a stabilitu bioprodukčních procesů. Robustní analytické metody jsou proto klíčové pro hodnocení kvality a konzistence peptonových preparátů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem tohoto příkladu aplikace je předvést využití Agilent 1290 Infinity II 2D-LC se zajištěním Active Solvent Modulation (ASM) pro detailní analýzu caseinových hydrolyzátů. Studie kombinuje gelovou permeační chromatografii (SEC) v první dimenzi a reverzní fázi (RPLC) ve druhé dimenzi, přičemž se testuje režim multiple heart-cutting i high-resolution sampling. K detekci slouží diodový array (DAD) a hmotnostní spektrometrie (MS). Faktory jako retenční čas, opakovatelnost a kvalita oddělení se sledují s cílem ukázat schopnost 2D-LC-ASM rozlišit šarže peptonů.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC systém s Active Solvent Modulation
• 1. dimenze: Agilent AdvanceBio SEC 130 Å, 4,6×300 mm, 2,7 µm; isokratická eluce voda/ACN 70/30 + 0,1 % TFA; průtok 0,2 mL/min; T 23 °C
• 2. dimenze: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD, 3,0×50 mm, 1,8 µm; gradient 0,1 % H₃PO₄/H₂O–ACN; průtok 1,2 mL/min; T 35 °C
• ASM: kapilára 0,12×85 mm, faktor proředění 5,1
• Multiple heart-cutting ventily se 40 µL smyčkami
• Detekce: DAD (214, 225, 280 nm, referenční 400 nm) a MS (Agilent 6130 ESI+, 100–1750 m/z)
• Software: OpenLab CDS ChemStation C.01.07 SR4, 2D-LC SW A.01.04

Hlavní výsledky a diskuse

• 1D-LC (SEC, RPLC) ukázala rozdíly ve velikostních frakcích a složitosti chromatogramů mezi komerčními a výzkumnými peptony.
• Bez ASM dochází k průniku polárních látek ve 2. dimenzi, což vede k deformaci špiček a nízké retenci.
• ASM významně potlačuje průnik, zlepšuje citlivost a obnovu raných sloučenin, tvar špiček je ostřejší.
• Retenční časy a plochy špiček v režimech heart-cutting i high-resolution sampling byly vysoce reprodukovatelné (RSD < 5 %).
• 2D-LC umožnila kvantifikovat a porovnat specifické oblasti chromatogramu napříč šaržemi, podpořené MS identifikací.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní monitoring kvality peptonů v bioprodukčních a farmaceutických procesech
• Vysoká selektivita a rozlišovací schopnost pro složité matricové vzorky
• Potlačení rušivých průniků vedoucích k přesněji definovaným špičkám
• Spolehlivá diferenciace šarží a možnosti kvantifikace specifických frakcí

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace 2D-LC s vysokorychlostní hmotnostní spektrometrií pro komplexnější charakterizaci
• Automatizace a optimalizace ASM parametrů pro zkrácení doby analýzy
• Vývoj nových modulací rozpouštědel a kombinace s dalšími technikami (NMR, FTIR)
• Uplatnění strojového učení pro interpretaci a zpracování 2D chromatografických dat

Závěr

Návrh 2D-LC s ASM pro analýzu peptonů prokázal vysokou efektivitu a reprodukovatelnost. Metoda potlačuje nevýhodné průniky, zvyšuje kapacitu separace a umožňuje detailní srovnání šarží, což je klíčové pro kontrolu kvality biologických reagencí.

Reference

1. Vanhoenacker G, Sandra P, Sandra K. Increasing Peak Capacity Using the Agilent 1290 InfinityLab 2D-LC Solution; Technical Overview 5991-6123EN, Agilent Technologies, 2015.
2. Stoll DR et al. Active Solvent Modulation: A Valve-Based Approach To Improve Separation Compatibility in Two-Dimensional Liquid Chromatography; Anal. Chem. 2017, 89, 9260–9267.
3. Krieger S. The Agilent InfinityLab 2D-LC Solution with Active Solvent Modulation; Technical Overview 5991-8785EN, Agilent Technologies, 2017.
4. Apffel A et al. Enhanced Sensitivity for Peptide Mapping with ESI LC-MS in the Presence of Signal Suppression due to Trifluoroacetic Acid-Containing Mobile Phases; J. Chromatogr. A 1995, 712, 177–190.
5. Kostiainen R, Kauppila TJ. Review: Effect of Eluent on the Ionization Process in LC-MS; J. Chromatogr. A 2009, 1216, 685–699.