Identification of NISTmAb Charge Variants by Fully Automated Capillary Isoelectric Focusing and Mass Spectrometry

Význam tématu

Analýza heterogenity náboje monoklonálních protilátek je klíčovým krokem v charakterizaci kvality bioterapeutik, protože rozdíly v izoelektrickém bodu ovlivňují stabilitu, aktivitu a imunogenicitu léčivých proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Tento Application Note ukazuje implementaci plně automatizovaného online workflow kombinujícího kapilární isoelectric focusing a hmotnostní spektrometrii (CIEF/MS) pro přímou identifikaci charge variant referenčního materiálu NISTmAb. Studie demonstruje vysoké rozlišení separace, spolehlivost a přesnost měření hmotnosti intactních protilátek.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda spočívá v separaci charge variant CIEF na kapilárovém elektroforézním systému Agilent 7100, následném přenosu separovaných zón do časově-of-flight MS Agilent 6230B prostřednictvím elektrokineticky pumpovaného nanospray zdroje EMASS-II. Klíčové parametry:

• Separace pomocí kapilár s délkou 60 a 75 cm a neutrálním coatingem
• Použití směsi Pharmalyte pH 3–10 a 8–10,5 v poměru 1:4 pro optimální rozlišení basic a acidic variant
• Mobilizace hydrodynamickým tlakem 5 mbar a elektrickým polem 15–18,8 kV
• ESI napětí 2,4 kV, fragmentační napětí 380 V, suchý plyn 6 l/min při 365 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace poměru ampholyte umožnila rozlišení čtyř hlavních variant: dvě C-terminální lysinové varianty, jednu monomodifikovanou formu a jednu lysinovou glykovanou formu s hmotnostním posunem +162 Da. Délka kapiláry 75 cm zlepšila rozlišení acidic varianty. Reprodukovatelnost byla prokázána pěti opakovanými injekcemi s RSD migrace 3,7 % a hmotnostní odchylky jednotlivých variant pod 2 Da.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přímá identifikace intactních charge variant bez potřeby frakcionace
• Zvýšení standardizace analýzy monoklonálních protilátek v průmyslu
• Možnost porovnání různých preparátů a šarží na úrovni celé molekuly

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření této CIEF/MS platformy na rutinní QA/QC laboratoře, integrace vyššího počtu ampholyte systémů pro jemnější rozlišení a aplikace na multi-dimenzionální analýzy post-translačních modifikací u širokého spektra bioterapeutik.

Závěr

Plně automatizované online CIEF/MS na zařízeních Agilent a CMP Scientific poskytuje spolehlivý a vysoce rozlišený přístup k analýze intactních charge variant monoklonální protilátky NISTmAb. Metoda nabízí vysokou reproducibilitu a přesnost hmotnostních měření, což podporuje její nasazení v biotechnologickém vývoji a kontrole kvality.

Použitá instrumentace

• Agilent 7100 capillary electrophoresis system
• Agilent 6230B TOF LC/MS
• CMP Scientific EMASS-II CE/MS ion source
• Neutrálně potažené PS1 kapiláry (60 a 75 cm)
• Pharmalyte ampholytes pH 3–10 a 8–10,5
• Externí vysokonapěťový zdroj pro ESI

Reference

1. Zhu, G.; Sun, L.; Dovichi, N. J. J. Sep. Sci. 2017, 40(4), 948–953.
2. Dai, J.; et al. Anal. Chem. 2018, 90(3).
3. Dai, J.; Zhang, Y. Anal. Chem. 2018.
4. Ouyang, Y.; et al. Anal. Chem. 2018.
5. Turner, A.; Schiel, J. Anal. Bioanal. Chem. 2018.