Separation of Native Monoclonal Antibodies and Identification of Charge Variants: Teamwork of the Agilent 3100 OFFGEL Fractionator, Agilent 2100 Bioanalyzer and Agilent LC/MS Systems

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou jednou z nejrychleji se rozvíjejících skupin bioterapeutik s širokým využitím v léčbě různých onemocnění. Heterogenita těchto proteinů způsobená post-translačními modifikacemi (například deamidací, glykozylací nebo odštěpováním C-terminálních lyzinů) ovlivňuje jejich účinnost, stabilitu a bezpečnost. Precizní charakterizace těchto variant je zásadní pro vývoj, výrobu a kontrolu kvality biofarmaceutik, včetně biosimilars, aby se minimalizovalo riziko nežádoucích imunologických reakcí.

Cíle a přehled studie / článku

Úkolem studie je představit workflow složené z kombinace Agilent 3100 OFFGEL Fractionator, Agilent 2100 Bioanalyzer a Agilent LC/MS systémů pro separaci, kontrolu a identifikaci nabitých variant mAb. Studie demonstruje možnost pI-založené preparativní frakcionace v roztoku, následné ověření čistoty a velikosti proteinů a konečnou přesnou hmotnostní analýzu s cílem odhalit specifické modifikace glykanů či C-terminálních lyzinů.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow sestává z následujících kroků:

• Frakcionace pomocí Agilent 3100 OFFGEL Fractionator (pI 6–9, 24jaderná IPG strip, nativní podmínky)
• Analýza proteinové velikosti a čistoty na Agilent 2100 Bioanalyzer s Protein 230 kitem
• Redukce frakcí DTT a následná LC/MS analýza na Agilent 1290 Infinity LC systému spojeném s Agilent 6530 Accurate-Mass-Q-TOF MS

Parametry LC/MS zahrnují kolonu Poroshell 300 SB-C8 (2.1×75 mm, 5 μm), gradientní eluční režim s formiální kyselinou a n-propylalkoholem, ionizaci ESI v pozitivním módu a dekonvoluční algoritmus pMod pro získání zero-charge spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

OFFGEL frakcionací byly rozlišeny kyselé (frakce 3–7), hlavní (frakce 8) a zásadité (frakce 9–12) varianty mAb. Bioanalyzer potvrdil integritu ~150 kDa intactního mAb v hlavní frakci a vedlejší formy v okolních jádrech. LC/MS analýza odhalila v kyselé frakci mono-sialylované biantennární glykanové formy (G1FS1), v zásadité frakci zdvojené C-terminální lyziny (+128 Da) a hlavní variantu s neutrálními glykanovými formami (G0F, G1F, G2F). Tento dvoudimenzionální přístup poskytl dostatečné rozlišení a koncentrace pro detailní charakterizaci nabitých modifikací bez nutnosti daleko-dosahujícího čištění.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Preparativní separaci nabitých variant v roztoku
• Rychlou kontrolu integrity a velikosti proteinů pomocí Bioanalyzeru
• Přesnou identifikaci modifikací a glykanových forem s vysokým rozlišením Q-TOF MS

V praxi lze tento přístup implementovat v R&D laboratořích i QC odděleních biotechnologických firem pro validaci výrobních šarží, stabilitní studie a vývoj biosimilars.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj integrovaných mikrofluidních a masově spektrálních technologií pro rychlejší a citlivější screening mAb modifikací. Kombinace automatizovaných preparativních frakcí s vylepšenými algoritmy dekonvoluce a strojovým učením může poskytnout hlubší vhled do vzniku nových potranslačních variant a zkrátit dobu vývoje bioterapeutik.

Závěr

Popsaný workflow Agilent 3100 OFFGEL Fractionator + 2100 Bioanalyzer + LC/Q-TOF MS představuje účinné řešení pro komplexní charakterizaci nabitých variant mAb. Dává laboratořím nástroj pro detailní identifikaci modifikací, monitorování kvality a zajištění bezpečnosti bioterapeutik v průběhu vývoje a výroby.

Reference

1. FDA guidance on monoclonal antibodies, 2014.
2. Khawli LA et al. mAb 2010, 2(6):613–624.
3. Meert CD et al. Anal. Chem. 2010, 82:3510–3518.
4. Wenz C. Agilent App Note 5991-1142EN.
5. Wenz C. Agilent App Note 5991-2885EN.
6. Hörth P et al. Mol. Cell Proteomics 2006, 5:1968–1974.
7. Suresh Babu CV. Agilent App Note 5990-6521EN.
8. Agilent Protein 230 Kit Guide G2938-90055.
9. Ning T et al. Agilent App Note 5991-2225EN.