Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies and ADCs Using CE/MS

Význam tématu

Analýza nabitých variant monoklonálních protilátek a konjugátů protilátka-lék (ADCs) je klíčová pro zajištění kvality, stability a biologické aktivity bioterapeutik. Variace nabití vznikají chemickými a strukturálními modifikacemi během výroby a skladování, ovlivňují izoelektrický bod (pI) a mohou změnit účinnost nebo imunogenicitu léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat workflow pro separaci a kvalitativní identifikaci nabitých variant adalimumabu (Humira) a trastuzumab emtansinu (Kadcyla) pomocí kombinace kapilární izoelektrické fokusace (CIEF) a hmotnostní spektrometrie s Q-TOF detektorem. Autoři předkládají optimalizaci podmínek a popisují charakterizaci jednotlivých variant na základě posunu hmotnosti.

Použitá instrumentace

• CMP EMASS-II iontový zdroj pro CIEF/MS
• Agilent 7100 capillary electrophoresis systém
• Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF hmotnostní spektrometr

Použitá metodika

Pro separaci nabitých variant byla v kapiláře vytvořena pH gradace pomocí anodového (kyselého) a katodového (zásaditého) pufru z CIEF/MS kitu a směsi ampholytech (zwitterionty Pharmalyte). Profil pH upravovali podle očekávaného rozsahu pI analyzovaných protilátek. Po aplikaci vysokého napětí se proteiny zaostřily na pozicích odpovídajících jejich pI, následovalo nanoflow nanášení směsi eluátu a transportního roztoku do emitní špičky EMASS-II a ionizace ESI.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro Humira byly rozlišeny tři hlavní varianty: základní vrchol (M) a dvě bazické (B1, B2) a jedna kyselá varianta (A1). Deconvoluce hmotnostních spekter potvrdila modifikace spojené se ztrátou lysinu a deamidací.
U Kadcyla bylo identifikováno devět variant odpovídajících různým drogovým poměrům (DAR 0–8). Každý DAR vykazoval posun hmotnosti o ~956 Da, odpovídající jedné jednotce cytotoxického DM-1. Časové rozlišení a hmotnostní přesnost pod 10 ppm umožnily jasnou identifikaci každé varianty.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita separace nabitých variant podle pI bez denaturace proteinu.
• Online spojení CIEF a Q-TOF MS zajišťuje rychlou kvalitativní identifikaci modifikací.
• Nanoflow EMASS-II ESI zvyšuje citlivost a šetří vzorek.
• Metoda je snadno přizpůsobitelná různým proteinovým terapeutikům pouhou úpravou pH gradientu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace úplné automatizace přípravy vzorku a analýzy, včetně AI-řízené interpretace spekter. Dále se rozvíjí aplikace metody pro komplexnější bioterapeutika, glykované protilátky a vícenásobné konjugace. Kombinace CIEF s dalšími neutrálními detekčními technikami slibuje komplexnější pohled na heterogenitu biologických léčiv.

Závěr

Workflow CIEF/Q-TOF MS představuje robustní a citlivou metodu pro charakterizaci nabitých variant monoklonálních protilátek a ADCs. Umožňuje detailní profilaci modifikací, poskytuje cenné informace pro kontrolu kvality a podporuje další vývoj proteinových léčiv.

Reference

1. U.S. Pharmacopeia Charge Variant Analysis of USP Monoclonal Antibody Reference Standards, 2023.
2. Xu T. Automated Capillary Isoelectric Focusing-Tandem Mass Spectrometry for Qualitative and Quantitative Top-Down Proteomics. Anal. Chem. 2020;92(24):15890–15898.
3. Wang T. Monoclonal Antibody Charge Variants Identification by Fully Automated Capillary Isoelectric Focusing–Mass Spectrometry. Agilent application note 5994-0672EN, 2019.
4. Dai J. Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometry Method for the Separation and Online Characterization of Intact Monoclonal Antibody Charge Variants. Anal. Chem. 2018;90:2246–2254.
5. Xia J. Identification of NISTmAb Charge Variants by Fully Automated Capillary Isoelectric Focusing and Mass Spectrometry. Agilent application note 5994-1079EN, 2019.
6. Toraño JS. Advances in Capillary Electrophoresis for the Life Sciences. J. Chromatogr. B. 2019;1118–1119:116–136.