Size Exclusion Chromatography Analysis of a Monoclonal Antibody and Antibody Drug Conjugate

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) je zásadní analytická metoda pro detekci a kvantifikaci vysokomolekulárních agregátů a nízkomolekulárních fragmentů bioterapeutických proteinů. Čistota velikostních frakcí ovlivňuje imunogenní potenciál, farmakokinetiku a účinnost léčiv založených na monoklonálních protilátkách (mAb) a protilátka-lék konjugátech (ADC).

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat separační výkon Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 µm kolony s dvěma komerčními sub-2 µm SEC kolónami (Vendor A a Vendor B) při analýze monoklonální protilátky a modelového ADC. Hodnoceny byly parametry jako tvar a šířka píků, rozlišení mezi dimerem/monomerem a monomerem/fragmenty, a míra sekundárních interakcí.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf: Agilent 1260 Infinity II bio-inert quaternární pumpa, multisampler s chlazením, multikolonový termostat s výměníkem tepla a spektrofotometr UV při 220 nm.
• Kolony: AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 µm (4.6 × 300 mm), Vendor A SEC 200 Å 1.7 µm (4.6 × 300 mm), Vendor B SEC 250 Å 2.0 µm (4.6 × 300 mm).
• Mobilní fáze: 50 mM fosfátový pufr sodný, 200 mM NaCl, pH 7.0; průtok 0,35 mL/min; teplota 25 °C; objem injekce 1–2 µL.
• Software: Agilent OpenLab 2.2 CDS.

Hlavní výsledky a diskuse

AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 µm kolona prokázala nejostřejší a symetričtější píky monomeru a fragmentů ve srovnání s ostatními dvěma kolónami. Rozlišení dimer/monomer a monomer/LMW bylo nejvyšší (2,79 a 2,28). Backpressure byla mírně nižší než u Vendor A. Kolona Vendor B sice vykázala nejnižší tlak, ale za cenu širších píků a horšího rozlišení. Při analýze ADC demonstrovala AdvanceBio kolona významně redukované sekundární interakce s hydrofobními částmi konjugátu, čímž umožnila čisté vymezení LMW fragmentů (Rs = 2,55), zatímco ostatní kolony vykazovaly rozštěpené nebo rozmazané píky.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 µm kolony v QC laboratořích zvyšuje spolehlivost detekce agregátů a fragmentů mAb a ADC. Vysoké rozlišení a minimalizace nespecifických interakcí podporují přesnější kontrolu kvality, urychlují vývoj a zlepšují stabilitu bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj stationárních fází s optimalizovanou chemickou modifikací pro eliminaci sekundárních interakcí u hydrofobních molekul. Integrace SEC s hmotnostní spektrometrií pro lepší identifikaci variant, zrychlení analýz pomocí vysokotlakých systémů a automatizace přípravy vzorků představují klíčové směry pro rozšíření využití v biotechnologickém průmyslu.

Závěr

Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 µm kolona předčila srovnatelně maločásticové SEC kolony od dvou dalších dodavatelů v oblasti rozlišení, tvaru píků a redukce sekundárních interakcí pro mAb i ADC. Nabízí robustní řešení pro pokročilou charakterizaci velikostních variant bioterapeutik.

Reference

1. Rosenberg AS. Effects of Protein Aggregates: an Immunologic Perspective. AAPS J. 2006;8(3):E501–507.
2. De Groot AS, Scott DW. Immunogenicity of Protein Therapeutics. Trends Immunol. 2007;28(11):482–490.