Native SEC/MS Analysis of mAbs on an Entirely Biocompatible Flow Path

Význam tématu

Size exclusion chromatography coupled with mass spectrometry (SEC-MS) je nejdůležitější metodou pro analýzu monoklonálních protilátek (mAbs) za nondenaturačních podmínek, umožňuje detekci agregátů a fragmentů bez potřeby gradientu. Nicméně interakce s kovovými komponenty LC systému (nerez) a s částicemi stacionární fáze mohou vést k roztaženým špičkám, posunům retenčních časů a špatnému zotavení velkých molekul. Biokompatibilní průchod kapaliny je klíčový pro spojení SEC s MS bez offline desaltingu.

Cíle studie

Cílem studie bylo porovnat separační výkon tradičního nerezového LC systému a kolony s biokompatibilním řešením na bázi PEEK (polyether ether keton) pomocí Agilent 1290 Infinity II Bio LC a AdvanceBio SEC 200 Å PEEK-lined kolony. Studie testovala mobilní fáze: 150 mM fosfát (standardní) versus 100 mM a 50 mM octan amonný (volatile) s ohledem na chromatografické chování a kompatibilitu s MS.

Použitá instrumentace

• LC systémy: Agilent 1290 Infinity II (SST) a 1290 Infinity II Bio LC (biokompatibilní, bez železa, MP35N)
• Kolony: AdvanceBio SEC 200 Å, 1.9 µm, 4.6×150 mm (SST) a 2.1×150 mm (PEEK-lined)
• MS: Agilent 6545 LC/Q-TOF s technologií Jet Stream, ESI positive
• Pufry: 150 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH 7, 50 mM a 100 mM octan amonný
• Vzorky: gel filtration standard, trastuzumab, NISTmAb, brentuximab vedotin

Hlavní výsledky a diskuse

Na fosfátovém pufru dosáhly všechny kombinace SST i biokompatibilního systému dobrého rozlišení a zotavení HMW. Při použití octanu amonného klesl výkon na SST hardwaru – šířka a tailing špiček se zvýšily, HMW se ztratily. Biokompatibilní LC s PEEK-lined kolony udržel ostré špičky a obnovil HMW i při 50 mM octanu. SEC-MS analýza NISTmAb odhalila dimery, monomer s glykoformami G0, G0F, G1F, G2F a fragmenty LMW. Analýza ADC brentuximab vedotin ukázala rozdělení DAR 0–8, s DAR 4 jako hlavní, glykozylaci a subpopulaci s linkerem bez cytotoxinu.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené biokompatibilní řešení umožňuje přímé spojení SEC a nativního MS bez offline desaltingu, což zrychluje workflow a zvyšuje spolehlivost QA/QC v biofarmaceutickém vývoji. Klíčovým atributem je schopnost přesně měřit agregáty, glykoformy a DAR u ADC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na další proteinové léky a ADC, integrace s 2D-LC pro komplexní profilování a využití pokročilých MS analyzátorů a bioinformatických nástrojů pro detailní strukturální charakterizaci.

Závěr

Studie zdůrazňuje nezbytnost biokompatibilního průchodu pro nativní SEC/MS mAb. Agilent 1290 Infinity II Bio LC systém spolu s PEEK-lined AdvanceBio SEC kolonou a octanovým mobilem poskytuje vynikající rozlišení, vysokou návratnost HMW a robustní přímé hyphenování s MS.

Reference

1. Sandra K. et al. Modern Chromatographic and Mass Spectrometric Techniques for Protein Biopharmaceutical Characterization. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
2. Fekete S. et al. Theory and Practice of Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Aggregates. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 101, 161–173.
3. Fekete S. et al. Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 2016, 88, 480–507.
4. Goyon A. et al. Unravelling the Mysteries of Modern Size Exclusion Chromatography – the Way to Achieve Confident Characterization of Therapeutic Proteins. J. Chromatogr. B 2018, 1092, 368–378.
5. Arakawa T. et al. The Critical Role of Mobile Phase Composition in Size Exclusion Chromatography of Protein Pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 2010, 99, 1674–1692.
6. Goyon A. et al. Evaluation of Size Exclusion Chromatography Columns Packed with Sub-3 μm Particles for the Analysis of Biopharmaceutical Proteins. J. Chromatogr. A 2017, 1498, 80–89.
7. Schneider S.; Jegle U.; Dickhut C. Size Exclusion Chromatography Analysis of Antibody Drug Conjugates. Agilent Technologies application note 5991-8244EN, 2017.
8. Sandra K. et al. Characterizing Monoclonal Antibodies and Antibody–Drug Conjugates Using 2D-LC-MS. LCGC Europe 2017, 30, 149–157.
9. Vanhoenacker G.; Sandra P.; Sandra K. Minimizing the Risk of Missing Critical Sample Information by Using 2D-LC. LCGC Europe 2022, 35, 348–353.
10. Vandenheede I.; Sandra P.; Sandra K. Denaturing and Native Size-Exclusion Chromatography Coupled to High-Resolution Mass Spectrometry for Detailed Characterization of Monoclonal Antibodies and Antibody–Drug Conjugates. LCGC Europe 2019, 32, 304–311.
11. Goyon A. et al. Characterization of 30 Therapeutic Antibodies and Related Products by Size Exclusion Chromatography: Feasibility Assessment for Future Mass Spectrometry Hyphenation. J. Chromatogr. B 2017, 1065–1066, 35–43.
12. Murisier M. et al. The Importance of Being Metal-Free: The Critical Choice of Column Hardware for Size Exclusion Chromatography Coupled to High Resolution Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta 2021, 1183, 338987.
13. Nägele E. Elevate Your mAb Aggregate Analysis. Agilent Technologies application note 5994-2709EN, 2020.